清香桂红色与绿色茎干株系的RAPD差异分析
RAPD Difference Analysis between Red and Green Stem Plants of Sarcococca ruscifolia
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Keywords:
- Sarcococca ruscifolia /
- red stem /
- RAPD
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清香桂(Sarcococca ruscifolia)是黄杨科野扇花属植物中一种极具观赏价值的物种，又名青香桂、野扇花、野樱桃、胃友等，在中国云南、四川、贵州、广西、江西、湖南、湖北、陕西、甘肃等地均有分布。作为一种常绿小灌木，其叶片颜色亮绿，花色乳白具芳香味，核果球形猩红色，且栽培管理简单，耐荫耐寒，极宜作盆栽观赏或地被植物[1]。以清香桂的根及果实入药，具有理气止痛、祛风活络及补血养肝之功效，民间主要用于治疗急慢性胃炎、胃溃疡、风湿疼痛等[2]。邱明华等[3-4]对清香桂中的生物碱进行了分离鉴定和结构研究；马加等[5]发现清香桂正丁醇提取物和总碱具有明显的胃肠动力学样效应，推测其主要的活性成分是生物碱。除了上述园林观赏价值评价、化学成分和部分药理研究以外，前人还对清香桂开展了播种育苗[6]、组织培养[7]、光合生理[8]等研究，这些研究结果表明清香桂在园林绿化、新药资源开发等方面具有很高的价值。
在观赏园艺植物中，茎干或叶片颜色变异植株为观赏植物增添了一抹新意。通过选育，园艺工作者培育出多种广受人们喜爱的品系[9-10]。本课题组在清香桂资源收集和育苗过程中发现：一些茎干和叶脉为红色的清香桂植株与一般清香桂植株相比，除茎干和叶脉为红色外，别的性状皆一致，具有更佳的观赏栽培价值。为了探寻清香桂红色茎干/叶脉植株与普通绿色茎干/叶脉植株的遗传差异，本研究以2种清香桂为试验材料，采用RAPD分子标记技术对二者进行分析，以期找到可调控植物茎干或叶脉颜色变化的基因或相关标记，为快速改良或培育新的清香桂品种提供新的思路。
1. 材料和方法
1.1 试验材料
2013年12月从云南省昆明市、兰坪县、师宗县等地采集了不同种源的清香桂种子，混合后于2014年3月在云南省楚雄州禄丰县仁兴镇大平坝基地播种，当年底发现部分植株的茎干和叶背叶脉为红色，不同于一般常见的绿色茎干/叶脉植株。2015—2017年，采集红色茎干/叶脉清香桂植株的1~2叶片茎段进行扦插繁殖，扦插苗的茎干和叶脉仍为红色(图1)，表明该性状能稳定遗传。
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图 1 绿色和红色茎干/叶脉的清香桂实生大苗(a)和扦插幼苗(b)外观Figure 1. The appearance of perennial mother plants (a) and young cutting seedlings (b) between green and red stem/leaf vein plants in S. ruscifolia本研究以随机选择的14株清香桂普通植株G1~G14 (绿色茎干/叶脉)、14株红色植株R1~R14(红色茎干/叶脉)为供试材料，于2017年1月在温棚中扦插育苗，5月移栽至苗床，常规水肥管理。2017年11月采集其生长正常、无病虫害的叶片，每株3~4片，独立纸袋封装，置于放有硅胶的密封保鲜盒中带回实验室。
1.2 研究方法
1.2.1 总DNA制备
采用植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)提取清香桂叶片中的总DNA。称取0.1 g样品鲜叶，置于1.5 mL离心管中，加入5 mm钢珠，液氮冷冻后用球磨仪振荡研磨1.5 min；在离心管中加入400 μL缓冲液LP1和5 μL RNaseA，旋涡震荡1 min，室温静置10 min；加入130 μL缓冲液LP2，充分混匀，旋涡震荡1 min；12 000 r/min离心5 min，将上清液移至新的离心管中；加入900 μL缓冲液LP3，充分震荡混匀15 s；将所得溶液加入吸附柱中后过滤并舍弃；加入600 μL的漂洗液PW对吸附柱进行漂洗，12 000 r/min离心30 s，弃废液，漂洗2次；将吸附柱放回收集管中，12 000 r/min离心2 min，弃废液，将吸附柱置于室温或超净工作台放置30 min，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液；将吸附柱加至1个干净的离心管中，向吸附柱中间位置悬空滴加80 μL洗脱缓冲液TE，室温放置5 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中。取3 μL经0.8%琼脂糖凝胶电泳观测DNA质量，取1 μL用ND2000进行纯度和浓度检测，稀释成浓度为20 ng/μL的工作液，放入−20 ℃冰箱保存。
1.2.2 RAPD引物筛选及PCR扩增
RAPD引物由生工(北京)合成，分别为A、B、C、D、E、F、G、H、M和N共10套，每套20条，共200条。随机挑选8份样品的DNA，分别取30 μL混合为引物筛选所用的DNA模板。首先用混合DNA模板对200条RAPD引物进行筛选，选出扩增结果稳定、条带清晰的引物；然后用28个样品DNA检测引物的多态性并寻找差异性特征条带。用Biometra PCR扩增仪进行扩增，20 μL的PCR反应体系中，含10 μL 2×Es Taq MasterMix (康为世纪，含染料)、9 μL引物(5 μmol/L)、1 μL DNA模板。PCR扩增程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10个循环，每个循环退火温度下降1 ℃；94 ℃变性30 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃完全延伸5 min，4 ℃保存。PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳分离，以D2000为标记，经溴化乙啶(EB)染色，用凝胶成像仪(北京百晶)进行拍照和分析。
1.2.3 差异片段的回收与测序
结果中若出现重复性好且稳定的差异片段，则用对应引物在相同条件下进行扩增和电泳，重复2次，对差异性片段条带进行切胶回收和纯化，送至硕擎生物公司(昆明)进行测序。测序结果用DNAMAN 6.0软件分析，在NCBI数据库中进行BLAST分析。
2. 结果与分析
2.1 RAPD引物筛选结果
选用200条RAPD引物，用混合DNA模板初筛后获得扩增结果稳定、产物条带清晰的引物96条；经28份样品DNA模板检测多样性，其中43条引物具有多态性，但能在普通绿色茎干/叶脉植株G1~G14和特异红色茎干/叶脉植株R1~R14的多数样品(10/14)中稳定产生差异条带的引物有8个，分别是B05、B07、B15、C06、C16、M02、M09和N10；经多次重复扩增和电泳检测，只有3个引物(C06、M09和N10)能在绿色茎干/叶脉植株类型(G)和红色茎干/叶脉植株类型(R)中稳定地扩增，并产生清晰的差异性条带(图2)。
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图 2 引物C06、M09和N10对绿色和红色茎干/叶脉植株的RAPD-PCR扩增产物电泳结果注：G. 绿色茎干/叶脉植株，R. 红色茎干/叶脉植株，M. DNA分子量标记。箭头所指处为差异片段。Figure 2. RAPD-PCR patterns of primer C06, M09 and N10 among green and red stem/leaf vein plants in S. ruscifoliaNote: G. green stem/leaf vein plants, R. red stem/leaf vein plants, M. DNA marker. The arrows points to the different band between green and red stem/leaf vein plants.2.2 差异性条带的直观分析结果
由图2可知：在引物C06的扩增结果中，绿色茎干/叶脉类型的全部植株在800 bp附近的1个条带比红色茎干/叶脉类型植株的对应条带强，且片段大小肉眼看上去略小；红色茎干/叶脉类型的全部植株在350 bp附近都存在1条明亮条带，而绿色茎干/叶脉类型植株在相同位置无对应条带。在引物M09的扩增结果中，绿色茎干/叶脉植株类型的多数植株(11/14)在250、1 000 bp附近都有1条较弱的条带，而红色茎干/叶脉类型的全部植株在相同位置无对应条带。在引物N10的扩增结果中，绿色茎干/叶脉植株类型的多数植株(13/14)在250、1 000、1 800 bp附近都有1条较强的条带，而红色茎干/叶脉类型的全部植株在相同位置无对应条带。总的来说，3个引物能够在清香桂的绿色和红色茎干/叶脉植株类型间产生7个差异性条带，可看作7个特异标记，记为C06-350、C06-800、M09-250、M09-1000、N09-250、N09-1000和N09-1800。
由表1可知：7个差异性条带中，C06-800在绿色和红色茎干/叶脉植株类型间有强弱和大小差异，M09-250、M09-1000、N09-250、N09-1000和N09-1800均只在绿色茎干/叶脉植株类型中出现，仅C06-350只在红色茎干/叶脉植株类型中出现且表现为强带，故而认为C06-350是与清香桂红色茎干/叶脉特征紧密联系的1个标记。
表 1 引物C06、M09和N10在绿色和红色茎干/叶脉植株类型间产生的差异性条带Table 1. The different bands amplified using primer C06, M09 and N10 between green and red stem/leaf vein plants in S. ruscifolia引物编号
primer No.碱基序列
base sequence (5′→3′)差异性条带大小/bp
band size条带特征band feature 绿色类型green type 红色类型red type C06 GAACGGACTC 350 − +，s 800 +，s +，w M09 GTCTTGCGGA 250 +，w − 1 000 +，s − N10 ACAACTGGGG 250 +，w − 1 000 +，s − 1 800 +，s − 注：−/+ 代表条带的有无；s/w代表条带的强弱。
Note: −/+ represents the presence or absence of the bands; s/w represent the intensity of specific band (strong and weak).2.3 差异性条带的序列分析结果
条带M09-1000、N10-1000和N10-1800由于需要2个或以上的测序反应才能获知核苷酸序列结果，并且是绿色茎干/叶脉植株类型中才有的条带，所以未进行测序分析。其余4个条带通过测序分析后发现，每个条带在不同的个体中获得的核苷酸序列的碱基和长度不尽相同，如：C06-800在绿色茎干/叶脉植株类型中的序列长度在784~801 bp之间，序列碱基在不同个体间的一致性为51.73%，但在红色茎干/叶脉植株类型中的序列长度在803~827 bp之间，序列碱基在不同个体间的一致性为77.08%。由于C06-350只在红色茎干/叶脉植株类型中出现且表现为强带，所以重点对其进行测序和分析。在14个红色茎干/叶脉植株中，C06-350的核苷酸序列长度在352~381 bp之间，序列碱基在个体间的一致性为65.57%，其中一致性为95.04%的4个序列的同源比对分析结果如图3所示。将C06-350条带的测序结果在NCBI上进行BLAST比对，未搜索到同源的核苷酸或氨基酸序列。
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图 3 C06-350测序结果在4个红色茎干/叶脉植株中的碱基同源性比较注：下划线的10个碱基为引物C06序列。Figure 3. Alignment of base sequence of C06-350 band among four red stem/leaf vein plantsNote: The ten bases underlined were the sequences of primer C06.3. 讨论
彩叶或彩色植物是植株的叶片、茎干等非花器官能在全年或某一生长期较稳定呈现非绿色的植物类型，以其丰富的色彩、上佳的观赏价值而备受推崇。彩叶植物与观花植物混搭配置，组成了丰富多彩的园林景观，并且彩色植物的观赏期一般更长，因而具有更好的观赏价值。彩色变异植株在育种上具有重要的应用价值，可以丰富物种的遗传多样性，创制优异的新品种和新类型。彩色植物非绿色彩是内部遗传因子和外部环境因素共同作用形成的。内部因子主要是指植株体内的色素(如叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮类色素)和体内细胞环境，外部因子主要是指光照、温度等环境因素[11-15]。由于花色是最主要的观赏性状，因此对各类色素的化学组成、生物合成及其基因调控等研究都聚焦在花瓣上，对彩色植物变色机理的相关研究则较少。
目前的彩色植物研究主要是针对草本彩叶植物开展的，首先确定其彩色性状是否稳定，然后开展遗传规律、组织解剖构造、色素成分及含量、光合性状、花色素苷代谢合成途径关键基因及其调控元件等研究。排除逆境胁迫和生理病害导致的暂时性彩色现象外，一般的突变体彩色植株都能稳定遗传。本研究中的清香桂红色茎干/叶片类型为种质资源收集和繁育过程中发现，存在多个单株，扦插繁殖后仍表现稳定，所以认为其红色性状是稳定的，与榉树[16](Zelkova schneideriana)的红叶、黄叶性状在扦插和嫁接后依然与母株一致的情况相同。关于彩叶性状是质量性状还是数量性状的说法不一。大白菜[17](Brassica rapa ssp. pekinensis)和菠菜[18](Spinacia oleracea) F2代群体中的紫(红)叶与绿叶植株的分离比例为3:1，红叶性状对绿叶表现为显性；水稻(Oryza sativa)红色根/种皮突变体中的红色性状表现为显性[19]；生菜(Lactuca sativa)紫叶和绿叶亲本的杂交后代全部呈现浅红色，表明紫叶性状为显性，但受多基因控制[20]；紫叶白菜(Brassica rapa)的F2代群体的叶片颜色呈现连续性变化，紫色性状表现为数量性状[21]；甜荞(Fagopyrum esculentum) F2代群体中的红色茎秆与绿色茎秆植株的分离比例为9:7，红茎性状对绿茎表现为2对显性互补基因的遗传模式[22]；姜卫兵等[23]总结胡萝卜(Daucus carota)、向日葵(Helianthus annuus)、烟草(Nicotiana tabacum)、黄麻(Corchorus capsularis)等的叶色突变体中紫色或黄色性状对绿色为隐性。造成这种不同遗传现象的原因一方面可能是物种不同，另一方面则与性状的遗传起源有关，例如紫色大白菜的紫色性状就可能来源于紫红色芥菜、紫色小白菜、紫菜薹和紫红色芜菁[24]。本研究的清香桂为灌木，通过杂交探究茎干红色性状的遗传规律相对需要较长的周期，观察其红色变异植株天然存在但数量很少，推测茎干红色性状对绿色可能是隐性遗传，具体规律还需试验证实。此外，色素合成、叶绿体合成和叶肉细胞发育的相关基因在茎干/叶片上的差异性表达均会引起茎干/叶色发生变化。本研究发现清香桂普通绿色和特异红色茎干/叶片植株的RAPD-PCR产物间存在一定的特征条带，说明红色茎干/叶片植株的基因组DNA发生了某些变化，应该是属于遗传因素导致的稳定变异，且标记C06-350仅在红色茎干/叶脉植株中出现，为后续分子标记辅助清香桂彩色植物的育种和红茎/红叶相关基因的定位、克隆奠定了初步基础。
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图 1 绿色和红色茎干/叶脉的清香桂实生大苗(a)和扦插幼苗(b)外观
Figure 1. The appearance of perennial mother plants (a) and young cutting seedlings (b) between green and red stem/leaf vein plants in S. ruscifolia
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图 2 引物C06、M09和N10对绿色和红色茎干/叶脉植株的RAPD-PCR扩增产物电泳结果
注：G. 绿色茎干/叶脉植株，R. 红色茎干/叶脉植株，M. DNA分子量标记。箭头所指处为差异片段。
Figure 2. RAPD-PCR patterns of primer C06, M09 and N10 among green and red stem/leaf vein plants in S. ruscifolia
Note: G. green stem/leaf vein plants, R. red stem/leaf vein plants, M. DNA marker. The arrows points to the different band between green and red stem/leaf vein plants.
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图 3 C06-350测序结果在4个红色茎干/叶脉植株中的碱基同源性比较
注：下划线的10个碱基为引物C06序列。
Figure 3. Alignment of base sequence of C06-350 band among four red stem/leaf vein plants
Note: The ten bases underlined were the sequences of primer C06.
表 1 引物C06、M09和N10在绿色和红色茎干/叶脉植株类型间产生的差异性条带
Table 1 The different bands amplified using primer C06, M09 and N10 between green and red stem/leaf vein plants in S. ruscifolia
引物编号
primer No.碱基序列
base sequence (5′→3′)差异性条带大小/bp
band size条带特征band feature 绿色类型green type 红色类型red type C06 GAACGGACTC 350 − +，s 800 +，s +，w M09 GTCTTGCGGA 250 +，w − 1 000 +，s − N10 ACAACTGGGG 250 +，w − 1 000 +，s − 1 800 +，s − 注：−/+ 代表条带的有无；s/w代表条带的强弱。
Note: −/+ represents the presence or absence of the bands; s/w represent the intensity of specific band (strong and weak).
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期刊类型引用(2)
1. 白平，陈海云，张学星，周筑. 美丽马醉木新梢颜色多样性及园林应用. 林业科技通讯. 2022(11): 97-98 . 
百度学术
2. 彭丽芬，李新贵，陈通旋，黎媛，方晨臣. 野扇花研究进展. 贵州林业科技. 2019(02): 54-58 . 百度学术
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