版纳微型猪近交系CPN10克隆、亚细胞定位、组织表达和生物信息学分析
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关键词:
- 伴侣蛋白10 (CPN10) /
- 异种移植 /
- 亚细胞定位 /
- 组织表达 /
- 生物信息学
Cloning, Subcellular Localization, Tissue Expression and Bioinformatics Analysis of CPN10 Gene in Banna Mini-pig Inbred Line
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百脉根(Lotus corniculatus L.)是豆科百脉根属多年生牧草，又名牛角花、五叶草，是一种与紫花苜蓿相似的豆科牧草，有人称之为“瘠地苜蓿”[1]。百脉根原产欧亚大陆温带地区，北美、大洋洲、非洲北部也有分布。其粗蛋白含量高于其他豆科牧草，而粗纤维含量相对较低，是一种具有较高营养价值和栽培价值的优良牧草[2-3]，且叶量丰富，产量高，再生力强，用途广，世界各国都进行了引种栽培，多年来形成了很多地区品种[4-6]。云南省草地动物科学研究院于1983年从国外引种栽培了8个品种，但由于气候、环境的差异，都未在生产中大面积推广应用[7-8]。百脉根在云南省是一个广布种，云南省野生百脉根资源丰富。但目前，针对云南野生百脉根种质资源的评价、筛选研究较少[9]，因此，加大对野生百脉根种质资源的评价和筛选可以有效推进百脉根新品种的选育工作。
本研究对云南野生资源中甸百脉根和引进品种——帝国百脉根在云南迪庆州高寒地区的区域适应性和品种生产潜力进行评价，以期为百脉根的品种选育和生产种植提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试野生百脉根种子于2009年10月采于云南迪庆州香格里拉县小中甸，帝国百脉根种子购于云南绿盛美地草业有限公司。
1.2 试验地概况
试验地设在迪庆州香格里拉县小中甸，位于东经99°50′，北纬27°90′，海拔为3 200～3 220 m，年平均气温5.8 ℃，年均降雨量849.8 mm，无霜期120 d。土壤为褐土，有机质含量4.5%，pH 7.3。
试验材料于2010年4月栽种，试验小区采用随机区组设计，小区面积均为5 m×3 m，组间距为1 m，区间距为50 cm，条播，播种量一般为11.25 kg/hm2，播种深度0.5 cm，行距30 cm，并在试验地四周设置保护行。2013年11月在试验地进行株高、叶长、叶宽的测定，用0.5 m×0.5 m样方选取3个重复，齐地面刈割，测定每个品种的鲜草产量。随后全部置于烘箱于65 ℃下烘24 h，回潮恒重测定鲜草水分含量、茎叶比。并采集材料带回实验室进行生理指标的测定。形态指标重复10次，生理指标重复3次。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 形态
测定供试材料的自然植株高度、拉直植株高度、叶长和叶宽，重复10次。
1.3.2 生物量
取1 m2样区材料，测定地上部分、地下部分生物量及茎叶比，重复5次。
1.3.3 生理指标
测定供试材料叶片相对电导率、丙二醛、可溶性蛋白含量以及超氧化化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性；测定叶片和根中可溶性糖、脯氨酸含量[10-11]。
1.4 数据分析
采用SPSS 16.0和Excel 2003对数据进行统计分析和作图。
2. 结果与分析
2.1 中甸百脉根和帝国百脉根形态特征对比分析
中甸百脉根和帝国百脉根植株自然高度分别为14.4、20.3 cm，拉直高度为27.8、36.2 cm，叶长分别为1.65、2.22 cm，叶宽分别为0.84、1.36 cm。从图1可见：帝国株高、叶长、叶宽显著高于中甸(P<0.05)。总体来看，中甸百脉根植株个体较矮小，叶片狭小。
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图 1 帝国与中甸百脉根的形态特征对比分析注：小写字母表示两个地区之间存在显著差异(P<0.05); 下同。Figure 1. Comparison of morphological characteristics between Empire and ZhongdianNote：Different letters mean significant difference between two areas(P<0.05); the same as below.2.2 中甸百脉根和帝国百脉根生物量对比分析
从图2可见：中甸百脉根和帝国百脉根地下部分的鲜重分别为13.2、69.7 g，干重为3.0、20.1 g；地上部分的鲜重分别为46.7、86.6 g，干重为10.4、16.4 g，帝国百脉根单位面积生物量显著高于中甸百脉根(P<0.05)。同时，帝国百脉根茎叶比(1.22)显著低于中甸百脉根(2.43) (P<0.05)，可利用营养价值更高。总体上看帝国百脉根生产性能和产量价值更高。
2.3 中甸百脉根和帝国百脉根抗寒性生理指标的对比分析
从图3可见：帝国百脉根叶片相对电导率、可溶性蛋白含量略高于中甸百脉根，但差异不显著(P>0.05)。而供试帝国和中甸叶片丙二醛含量分别为5.37、12.33 μmol/g，帝国显著低于中甸(P<0.05)。
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图 3 帝国与中甸百脉根相对电导率、丙二醛、可溶性蛋白含量对比分析Figure 3. Comparison of relative conductivity, MDA and soluble protein content between Empire and Zhongdian从图4可见：供试材料叶片可溶性糖含量差异不显著(P>0.05)，而根中可溶性糖含量帝国显著高于中甸(P<0.05)。帝国百脉根叶片脯氨酸含量略高于中甸百脉根，但差异不显著(P>0.05)。而根中脯氨酸含量帝国(36.89 μg/g)显著低于中甸(58.40 μg/g)(P<0.05)。综合分析认为：帝国百脉根可通过降低叶片膜脂过氧化产物丙二醛含量、提高根中可溶性糖含量增强其在高寒地区的抗寒性。
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图 4 帝国与中甸百脉根叶片和根中可溶性糖与脯氨酸含量对比分析Figure 4. Comparison of soluble sugar and proline content in leaves and root content between Empire and Zhongdian2.4 中甸百脉根和帝国百脉根保护酶活性的对比分析
由图5可知：帝国和中甸叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性分别为993.6、1 403.4 U/(g·h)，过氧化物酶(POD)活性分别为85.0、119.0 μg/(g·min)，帝国均显著高于中甸(P<0.05)。
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图 5 帝国与中甸百脉根SOD、POD活性对比分析Figure 5. Comparison of SOD and POD activities between Empire and Zhongdian3. 讨论
株高不仅反映了品种的种群高度，而且在一定程度上反映了牧草生长能力的强弱，是衡量牧草高产的一个重要指标。崔亚飞等[12]研究表明：百脉根的自然高度影响百脉根的单株产量并且在提高单株草产量的育种工作中首先要考虑到自然高度这一影响因素。本研究结果表明：帝国百脉根在植株的自然高度、拉直高度都显著高于中甸百脉根，且其叶长和叶宽也显著大于中甸百脉根，表明帝国百脉根的生长能力和经济性状要优于中甸野生百脉根。同时，产量的测定也表明：帝国百脉根的地上部分的干重湿重、地下部分的干重湿重都显著高于中甸百脉根。所以在迪庆州香格里拉县格咱乡试验基地或者在与其相似的地域和气候环境中选择种植帝国百脉根其产量和经济性能都优于中甸百脉根。
当植物在逆境条件下时往往会发生膜脂过氧化作用，丙二醛作为膜脂过氧化产量之一，其含量往往能反应植物细胞膜的受伤害程度。从试验结果来看中甸百脉根中丙二醛含量显著高于帝国，暗示中甸百脉根在受到相同低温胁迫的时候细胞膜受伤害程度更大。植物体内，可溶性糖可以提高细胞液浓度，降低水势，从而使冰点下降，提高植物抗寒能力[13]。本研究中帝国百脉根根中的可溶性糖含量显著高于中甸百脉根中的含量，表明帝国百脉根可通过提高其根部内含物的寒冷增强其的抗寒性。植物受到逆境胁迫时体内的脯氨酸含量会显著增加。中甸百脉根的根中的脯氨酸含量显著高于帝国，表明中甸百脉根对寒冷反应更加敏感。植物内源保护酶系超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)是植物细胞抵御活性氧伤害的重要保护酶[14]。从本研究的结果可以看出：帝国百脉根超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性都显著高于中甸百脉根。表明帝国百脉根可通过提高保护酶活性来加强对活性氧伤害的抵御能力。同时，两种百脉根中相对电导率差异、可溶性蛋白含量差异不显著，说明百脉根作为冷季型牧草，对寒冷都有一定的抵御能力。
4. 结论
本研究表明：帝国百脉根植株更高大，牧用经济性能更高。在迪庆州香格里拉县小中甸试验基地或者在与其相似的地域和气候环境中种植百脉根则帝国百脉根的产量和经济价值优于中甸百脉根。
对供试材料的相对电导率、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物歧化酶(POD)活性分析表明，帝国百脉根的抗寒性优于中甸百脉根。帝国百脉根能适应中甸地区高寒生境，且在相对寒冷的地区选择种植帝国百脉根比选择中甸百脉根更好。
总之，在迪庆州香格里拉县小中甸试验基地或在与其相似的地域和气候环境中或者更寒冷的地区帝国百脉根的区域适应性优于中甸百脉根。
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图 1 CPN10基因PCR结果
注：M. DNA相对分子质量标准DL2000；1. 引物F1/R1扩增的PCR产物。
Figure 1. The PCR result of CPN10
Note: M. Marker-DL2000; 1. PCR product amplified by primers F1/R1.
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图 2 BMI CPN10真核表达PCR产物电泳结果
注：M. DNA相对分子质量标准DL2000；1. 引物F3/R3扩增的PCR产物。
Figure 2. The agarose gel electrophoresis result of eukaryocyte expression PCR products of BMI CPN10
Note: M. Marker-DL2000; 1. PCR product amplified by primers F3/R3.
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图 3 pEGFP-C1-CPN10重组质粒在PK15细胞中亚细胞定位
注：a)绿色荧光蛋白；b) Hoechst33342对细胞核的染色；c) Mito Tracker对线粒体的染色；d)绿色荧光蛋白与细胞核的叠加；e)绿色荧光蛋白与线粒体的叠加；f)绿色荧光蛋白、细胞核和线粒体的叠加。
Figure 3. Subcellular localization of pEGFP-C1-CPN10 recombinant plasmids in PK15 cell
Note: a) green fluorescent protein; b) nucleus staining by Hoechst33342; c) mitochondria staining by Mito Tracker; d) superposition of green fluorescent protein with nucleus; e) superposition of green fluorescent protein with mitochondria; f) superposition of green fluorescent protein, nucleus and mitochondria.
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图 4 BMI CPN10基因27个组织的mRNA表达谱
Figure 4. The mRNA expression profile 27 tissues of BMI CPN10 gene
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图 5 BMI CPN10基因编码序列及其对应的氨基酸序列
注：ATG为起始密码子；*为终止密码子；方框为保守结构域：8~100 AA (CPN10)。
Figure 5. The coding sequence of BMI CPN10 gene and its corresponding amino acid sequence
Note: ATG. start codon; *. stop codon; the conserved domain is boxed: 8-100 AA (CPN10).
表 1 PCR引物
Table 1 List of PCR primers
引物名称primer name 引物序列(5′→3′) primer sequences 产物大小/bp product size 用途usage CPN10-F1 CATGGCAGGACAAGCATTTA 343 序列克隆sequence cloning CPN10-R1 GCTTCATGTGATGCCATTAGAC CPN10-F2 CGTAGTAGCTGTTGGATCAGG 167 荧光定量qPCR CPN10-R2 CGTATTTTCCAAGAATGTCACC CPN10-F3 CCGGAATTCATGGCAGGACAAGCATTTAG 326 真核表达eukaryotic expression CPN10-R3 CGGGATCCTCAGTCTACGTATTTTCCAAG GAPDH-F CCTTCATTGACCTCCACTACATGGT 183 内参internal reference GAPDH-R CCACAACATACGTAGCACCAGCATC 
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表 2 预测的BMI CPN10氨基酸磷酸化位点
Table 2 The prediction results of BMI CPN10 phosphorylated sites
基因
gene磷酸化氨基酸
phosphorylated amino acids位置
position分值
scoreCPN10 丝氨酸serine 21 0.723 64 0.988 53 0.507 苏氨酸threonine 79 0.563 酪氨酸tyrosine 100 0.565
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表 3 BMI CPN10功能预测
Table 3 Prediction of CPN10 function in BMI
功能分类functional category 概率probability 基因本体分类gene ontology category 概率probability 氨基酸合成amino acid biosynthesis 0.011 信号转导signal transducer 0.093 辅因子生物合成biosynthesis of cofactors 0.061 结构蛋白structural protein 0.018 细胞被膜cell envelope 0.034 转运transporter 0.025 细胞过程cellular processes 0.110 离子通道ion channel 0.009 中间代谢中枢central intermediary 0.060 阳离子通过cation channel 0.010 能量代谢energy metabolism ≥0.334 电压门控离子通道voltage gated ion channel 0.004 脂肪酸代谢fatty acid metabolism 0.032 应激反应stress response 0.024 嘌呤和嘧啶purines and pyrimidines 0.090 免疫反应immune response 0.052 调节功能regulatory functions 0.019 生长因子growth factor 0.007 复制和转录replication and transcription 0.113 转录调节transcription regulation 0.029 翻译translation 0.116 转录transcription 0.029 转运和结合transport and binding 0.021
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百度学术
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