化学杀虫剂的大量使用已造成日益严重的环境污染和农药残留问题，生物防治逐渐成为一种解决农林害虫危害的重要措施。绿僵菌属真菌是一种应用广泛的杀虫真菌，在自然界昆虫种群调控中发挥着重要的调控作用^[1]。绿僵菌具有分布广泛、寄主谱较广、安全无毒等优点，已被成功应用于防治蝗虫、金龟子、象甲等多种害虫的田间防治^[2]。然而，绿僵菌在田间应用过程中对害虫的防效往往效果不稳定，极大地制约了其规模化生产与应用^[3-4]。绿僵菌是以活体侵染形式发挥杀虫作用的，其侵染过程包括体表附着、体壁穿透及体内定殖和致死等不同阶段，周围环境因素必然会影响其定殖和杀虫效果，因此菌株的抗逆性状直接关乎其田间防效和稳定性^[4]。研究在逆境胁迫条件下绿僵菌抗逆相关基因的表达将为进一步了解杀虫真菌的抗逆和毒力机理奠定基础。

不同生物在应对逆境过程中进化产生了既保守又高度分化的调控系统，其中高渗透性甘油促分裂原活化蛋白激酶(MAPK-Hog1)途径是很多物种在渗透压胁迫环境中被激发的一条高度保守的重要的信号转导途径^[5]。研究表明：虫生真菌的MAPK-Hog1信号途径对盐胁迫、紫外线胁迫、温度胁迫等因素具有重要的调控适应作用^[6-7]。Hog1基因是该信号传导途径的重要组分，可提高细胞的耐渗透压能力，在多种胁迫条件下该类基因会被激活^[8]。高渗压是自然界中普遍存在的一种环境胁迫因子，细胞质中的Hog1蛋白在渗透压胁迫下快速磷酸化后转移到细胞核，激活甘油合成相关酶基因，从而抵抗不良环境^[7-8]。虫生真菌自身的耐逆性能对其环境适应能力起着重要作用，同一种内的不同菌株对逆境的耐受能力可能存在较大差异^[9]。

绿僵菌菌株MAX-2在干旱条件下具有较高的耐逆侵染活性^[10]，但对其耐逆机理尚缺乏认识，限制了该优良菌株的生防利用。以绿僵菌菌株MAX-2与其他耐逆性能差的绿僵菌菌株为研究对象，分析其在盐胁迫和紫外线胁迫条件下Hog1基因的表达差异，为揭示绿僵菌菌株MAX-2的耐逆侵染机理提供一定理论依据，为该菌株的生防应用奠定一定基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

具有较好耐逆性能的绿僵菌优良菌株MAX-2和2个不同耐逆性能的绿僵菌菌株BUM2495、BUM723。各菌株保存于云南保山学院高黎贡山生物资源研究所。

1.2   研究方法

1.2.1   盐诱导处理

各绿僵菌菌株在PPDA培养基平皿上培养15 d后得到大量分生孢子，分别用浓度为0.4 mol/L和0.8 mol/L的盐水制成1×10⁵ mL⁻¹孢子悬浮液，25 ℃培养12 h。

1.2.2   紫外线诱导处理

将各菌株孢子用无菌水制成1×10⁵ mL⁻¹孢子悬浮液，分别取5 mL于培养皿中，在30 W紫外灯下距离20 cm开盖照射5 min、15 min。

1.2.3   孢子耐盐性和耐紫外照射能力

各菌株孢子悬浮液经过盐处理和紫外线处理后，分别取0.1 mL涂布接种于水琼脂片上，培养24 h后在显微镜下统计孢子萌发率。每个处理做3次重复，取平均值。以未经逆境处理的孢子悬浮液为对照。

孢子萌发率数据用SPSS 20软件进行方差分析，F检验(α=0.05)差异显著者，采用Duncan新复极差法检验^[11]，分析比较不同菌株间的差异，结果用x±S表示。

1.2.4   半定量RT-PCR分析Hog1基因的表达

各菌株孢子经过盐处理和紫外线处理后，立即取样，采用柱式真菌RNAout试剂盒(北京天恩泽)提取各样品的总RNA，用RNase-Free DNase酶解去除RNA中残留的DNA。用核酸蛋白分析仪测定总RNA的纯度和浓度。取相同量(800 ng)的RNA进行逆转录，保证模板在同一水平，用逆转录试剂盒(北京天恩泽)合成cDNA第一链。

用JIN等^[12] 报道的MaHog1基因(EFY85878)序列在NCBI中进行同源性比对，找到Metarhizium acridum中MaHog1的cds序列(GenBank：JQ691634.1)，根据引物设计原则用Primer 3.0在线软件设计特异性引物(F: 5′-ccagttctccatcatcacc-3′，R: 5′-gtagccgtaatccgcttct-3′，退火温度T_m为58 ℃，产物大小210 bp)进行RT-PCR扩增和半定量分析。以绿僵菌GAPDH基因作为内参基因，引物序列为F: 5′-gactgcccgcattgagaag-3′和R: 5′-agatggaggagttggtgttg-3′，退火温度T_m为58 ℃，产物大小149 bp^[13]。

PCR反应体系为20 μL：10 μL 2 × EasyTaq PCR Supermix，1 μL正向引物(10 μmol /L)，1 μL反向引物(10 μmol/L)，1 μL cDNA，7 μL水。

扩增程序为：94 ℃预变性3 min；30 个循环为94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s；最后72 ℃保温5 min。取5 μL PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶检测。

2.   结果与分析

2.1   逆境胁迫条件下各菌株的分生孢子萌发率

对照中3个绿僵菌菌株的自然孢子萌发率差异不显著(都达88%左右)，不同浓度盐胁迫条件下，菌株间的分生孢子萌发率差异都达到极显著水平(P<0.01)。总体上，随NaCl浓度的增加，各菌株的孢子萌发率下降，MAX-2下降速度最慢，其次为BUM2495，孢子萌发率下降最快的是BUM723 (表1)。用0.4 mol/L的NaCl处理，MAX-2的孢子萌发率降低为59.8%，BUM2495降低为46.2%，BUM723则降低到27.5%。用0.8 mol/L的NaCl处理，MAX-2的孢子萌发率降低为41.2%，BUM2495降低为22.1%，BUM723则降低到13.5%。

紫外线照射不同时间下，3株菌的孢子萌发率差异都达到极显著水平(P<0.01)。随紫外线(UV)胁迫时间的延长，各菌株的孢子萌发率降低，其中受紫外线照射影响最小的是菌株MAX-2，其次是菌株BUM2495，对紫外线照射最敏感的是菌株BUM723。紫外线照射5 min后，MAX-2的萌发率仍能达到58.3%，BUM2495的萌发率降低为36.3%，BUM723的萌发率降低为27.2%。紫外线照射15 min后，MAX-2的萌发率达27.7%，BUM2495的萌发率降低为13.3%，而BUM723的孢子很少萌发(6.1%)。

表  1  逆境条件下各绿僵菌菌株的孢子萌发率

Table  1.  Conidial germination rates of Metarhizium strains under adversity stresses

菌株strain	对照contrast	孢子萌发率/% conidial germination rate
		NaCl处理NaCl treatment			紫外线照射UV irradiation
		0.4 mol/L	0.8 mol/L		5 min	15 min
MAX-2	88.4±0.5 A	59.8±0.5 A	41.2±0.4 A		58.3±0.5 A	27.7±0.7 A
BUM2495	87.3±0.4 A	46.2±0.6 B	22.1±0.8 B		36.3±0.5 B	13.3±0.4 B
BUM723	87.3±0.2 A	27.5±0.4 C	13.5±0.6 C		27.2±0.5 C	6.1±0.1 C
注：同列数字不同字母表示差异达到极显著水平P<0.01。 Note: For same columns, different letters mean extremely significant difference at P<0.01.

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2.2   逆境胁迫条件下各菌株Hog1基因的表达

抗逆能力不同的3个绿僵菌菌株，分别用不同浓度的盐(0.4、0.8 mol/L NaCl)处理和紫外线照射不同时间(5、15 min)后，通过半定量RT-PCR测定Hog1基因的表达活性。结果(图1)显示：两种逆境处理条件下，3个菌株中的Hog1基因的表达量都明显增加，说明绿僵菌Hog1基因对这两种逆境都具有响应。

在绿僵菌正常生长过程中，检测到的Hog1基因表达量较低，30个循环的PCR在3个菌株中都只能检测到该基因的少量表达。盐处理明显诱导了Hog1基因的表达，但不同菌株的表达水平不同。在0.4 mol/L NaCl的胁迫下，MXA-2和BUM2495的表达量增加都很明显，而BUM723的转录表达只有轻微上调。在0.8 mol/L NaCl的胁迫下，MXA-2的表达量虽略有减弱，但仍保持较高水平；BUM2495的表达量明显弱于MXA-2；BUM723的表达量最低，与对照相似(图1a)。

图  1  逆境条件下绿僵菌菌株Hog1基因的表达

Figure  1.  Expression of Hog1 in different strains under adverse stresses

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在紫外线照射条件下，3个绿僵菌菌株中Hog1基因的表达量也都明显增加(图1b)。紫外线照射5 min，3个菌株的基因表达上调仍然是MAX-2>BUM2495>BUM723，但菌株之间的表达差异小于0.4 mol/L的盐胁迫。紫外线照射15 min，3个菌株的基因表达都有减缓的趋势，MAX-2仍有较高表达量，但BUM2495与BUM723两菌株的表达量明显减弱，几乎与对照差不多。

3.   讨论

MAPK-Hog1途径是MAPK信号途径中耐高渗分支，存在于许多生物中，Hog1是该途径最下游的1个蛋白激酶，也是该途径的核心分子^[5]。很多研究认为：Hog1基因在真菌中具有较保守的功能，与细胞应对多种胁迫条件相关^[12]。郑大伟^[14]的研究表明：Hog1基因的缺失导致了稻曲病菌突变体对渗透压敏感程度的升高。赵建华^[8]研究认为：在NaCl渗透压力和紫外线胁迫下，敲除了BbHog1基因的白僵菌突变体的孢子萌发和菌丝生长都受到明显抑制。任璐等^[15]根据丝状真菌中Hog1的保守氨基酸序列设计简并引物，克隆了番茄早疫病菌的Hog1的同源基因AsHog1，并采用Real-time RT-PCR技术证实经NaCl处理后，AsHog1的相对表达量增加了4倍多。在绿僵菌中Hog1基因的作用也已有不少报道，主要是从缺失突变体的角度来进行研究。JIN等^[12]敲除了Hog1基因后，绿僵菌突变体对多种逆境的敏感性增加；明月^[16]通过基因敲除和回复技术分析，认为绿僵菌的Hog1基因与菌株对高渗、高温耐受力、氧化应激和细胞壁抑制剂的敏感性有关。但关于绿僵菌Hog1基因在逆境条件下的表达情况，目前尚未见相关的报道。

云南省很多地区气候干燥、紫外线强，前期研究表明：绿僵菌菌株MAX-2对干旱和紫外线辐射具有较强耐受能力^[17]，进一步探索其耐逆分子机理将为该菌株的实际开发利用奠定理论基础。孢子萌发试验表明：3个绿僵菌菌株的自然孢子萌发率差异不显著，但2种逆境(NaCl和紫外线处理)条件下，菌株间的孢子萌发率差异都为极显著。随NaCl浓度增加，3个不同耐逆性能的菌株分生孢子萌发率都下降，MAX-2的孢子萌发率下降速度较慢，整体萌发率最高，表现出较高的耐盐潜力；BUM2495耐盐性其次，而BUM723的耐盐能力最差。随紫外线照射时间增加，3个菌株的孢子萌发率也都下降，MAX-2也表现出较高的耐逆性，BUM2494对紫外线的耐受能力居中，BUM723的耐受能力最差。

绿僵菌菌株MAX-2中Hog1基因的表达是否对其较高的耐旱性能具有积极作用尚属未知。绿僵菌Hog1基因转录表达分析表明：盐胁迫和紫外线胁迫下，3个菌株的Hog1基因转录表达都表现上调，菌株MAX-2中Hog1基因的整体转录表达水平最高，耐盐性最差的菌株BUM723中Hog1基因的整体转录水平最低，说明菌株MAX-2的耐逆性能与Hog1基因的转录表达密切相关。从不同菌株的耐受能力来看，浓度为0.4 mol/L NaCl的胁迫和紫外线照射5 min，MAX-2的表达量都只略高于BUM2495，但NaCl浓度提高为0.8 mol/L、紫外线照射时间延长为15 min时，MAX-2的表达量都明显高于BUM2495，推测在较高逆境条件下Hog1基因的高水平表达增加了MAX-2的耐逆性能。这与多数前人的研究结果一致。向婷^[5]证明了菌根真菌Hog1转录与盐胁迫之间的关系，NaCl胁迫提高了R.iHog1的表达量；王晨莹^[18]报道：0.5 mol/L NaCl刺激下，重组了Hog1基因的酵母菌株比Hog1缺失突变株转录水平明显增强，达到野生型菌株的水平；王园园^[19]通过半定量RT-PCR分析酵母Hog1基因的表达认为：耐盐优良酵母菌株T3-5的Hog1基因转录水平增强是导致其耐盐性提高的一个重要原因。但也有一些研究报道不同。饶玉春等^[20]的研究认为：盐胁迫下稻曲病菌的UvHog1基因相对表达量明显降低；任璐等^[15]报道：NaCl和异菌脲处理后，番茄早疫病菌抗性菌株的表达量变化不大，敏感菌株的AsHog1基因表达量持续升高，使胞内甘油过量积累致细胞涨破死亡；而岳华^[21]则认为：酵母对盐胁迫强烈应答的多数基因都依赖Hog1基因，该基因的过量表达载体转化拟南芥，提高了植株的耐盐能力。这些研究的差异可能是由生物材料、盐浓度和时间点等不同导致的。从逆境处理的强度来看，3个菌株都在0.4 mol/L的NaCl胁迫下Hog1基因表达水平最高，NaCl浓度增加为0.8 mol/L时表达水平减小，说明盐浓度增加过高会削弱Hog1基因的表达量。这与已有报道相似。王园园^[19]的研究也认为：盐含量的增加会抑制细胞活力，Hog1基因表达减弱；饶玉春等^[20]的研究结果也表明：低浓度NaCl处理Hog1基因的相对表达量高于高浓度NaCl处理。同理，紫外线照射时间增加也可能抑制了细胞的活力，本研究中紫外线照射时间5 min后Hog1基因表达量最高，照射时间延长至15 min后Hog1基因的表达量相对减弱。