不同氮素水平下追氮时期对小麦淀粉粒度分布的影响
Effects of Nitrogen Topdressing Stages on the Starch Granule Size Distribution in Wheat Grains under Different Nitrogen Rates
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Keywords:
- wheat /
- nitrogen /
- nitrogen topdressing stage /
- starch granule
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NPR1 (nonexpresser of pathogenesis-related genes1)基因在植物的系统获得抗性(systemic acquired resistance，SAR)中起关键的作用[1]。SAR为存在于植物中、以病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins，PR)表达为特征的广谱抗性，并需要水杨酸(salicylic acid, SA)信号转导的诱导[2]。CAO等[3]在1994年分离到1株缺乏水杨酸-2，6-二氯异烟肼(2,6-dichloroisonicotinic acid，INA)表达的拟南芥npr1突变株，该植株不能对各种SAR诱导物处理做出应答反应。随后NPR1得到了广泛深入的研究[4]，并成为植物水杨酸介导的抗病信号转导通路的标志基因。因此，在涉及水杨酸信号转导途径的研究中，npr1是一个重要的实验材料。本研究对经EMS (ethylmethane sulfonate)诱变的拟南芥npr1-2突变体的纯合性进行了检测，然后利用qRT-PCR技术对NPR1基因表达水平进行测定，并用水杨酸敏感性试验加以验证，为进一步研究NPR1与其他基因的关系，以及为水杨酸信号途径的功能研究提供试验材料。
1. 材料与方法
1.1 植物材料和种植管理
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia (Col-0)生态型。npr1-2突变体购自美国Lehle seeds公司，为Col-0生态型背景。种子用次氯酸钠消毒液浸泡10~15 min进行表面消毒；灭菌水冲洗3~5次，确保冲洗干净。将种子点播在固体Murashige Skoog (MS)培养基上，培养皿用parafilm封口膜封口，置于4 ℃冰箱中2~3 d进行春化处理。然后移入12 h光照/12 h黑暗、22 ℃的光照培养箱中。培养1周后，将幼苗逐苗移栽到装有V(营养土):V(蛭石)为2:1的小盆中，浇适量水后盖上透明塑料薄膜并放入组培室中培养，3 d后揭去薄膜，在拟南芥的生长过程中注意定期浇水和除虫管理。用于水杨酸敏感性试验的拟南芥种子播于含有28 μmol/L水杨酸的MS培养基上，进行垂直培养，以便观察根的生长情况。组培室的条件为：光照强度约50 μmol/(m2·s)，12 h光照/12 h黑暗，相对湿度60%~70%，温度22~23 ℃。
1.2 基因组 DNA 提取
按Edwards法提取[5]：从拟南芥植株上剪取叶子1~2 片，置于1.5 mL的离心管中研磨成匀浆。加入400 μL的Edwards提取液研磨后12 000 r/min离心。上清转移用异丙醇混匀，冰浴或−20 ℃放置5~10 min。12 000 r/min离心5 min，沉淀用70%的乙醇洗1次，在空气中干燥，溶于20~50 μL的灭菌水中，−20 ℃保存备用。
1.3 纯合突变体的鉴定
npr1-2为经化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate，EMS)诱变的点突变体[3]，在npr1-2的突变点附近，设计NPR1鉴定引物：5′-AGACTCTTGCCTCTTAGTGT-3′；5′-GAGCGAAACTATATGACGCC-3′。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker为Biomed 公司的BM2000+。电泳后，将清晰明亮的条带切下，由上海life有限公司测序，将测序结果与网站序列进行比对。
1.4 荧光实时定量PCR
利用Trizol法提取拟南芥组织总RNA，用分光光度计(NanoDrop 2000 Thermo Scientific，USA)测定浓度及OD260/OD280比值，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。按照HiScript II Q RT SuperM.ix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)说明操作，将待测RNA逆转录成cDNA。逆转录完毕后加入90 μL Nuclease-free H2O储存在−20 ℃冰箱备用。实时荧光定量RT-PCR测定利用QuantiFast® SYBR® Green PCR Kit试剂盒(Qiagen，Germany)在LightCycler® 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上进行反应，以18 sRNA基因作为内参，每个样品做3次重复。
2. 结果与分析
2.1 突变位点和纯合性鉴定
npr1-2为EMS诱变碱基替换突变，在突变位置附近设计引物，npr1-2的两引物之间的长度为575 bp；试验提取了9个不同npr1-2突变体株系叶片的DNA，用所设引物进行PCR扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到了9条预期的扩增条带(图1)。切割条带，进行DNA碱基序列的测定(图2)。
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图 1 npr1-2突变位点片段的PCR扩增注：M. BM2000+ Marker; WT. 野生型；1~9. 9个不同npr1-2 株系。Figure 1. Amplification of mutant segment in npr1-2 plant by PCRNote：M. BM2000+ Marker; WT. wild type; 1~9. nine different strains of mutant npr1-2.将测序结果在TAIR网上与NPR1基因的序列进行对比，结果显示：npr1-2突变体的第152个碱基G突变成了A，即由野生型的半胱氨酸TGC突变为酪氨酸TAC，符合npr1-2所产生的点突变(图2)[1]。同时检测到npr1-2的杂合体和纯合体(图3)，保存纯合的npr1-2。
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图 2 npr1-2突变片段的测序结果以及突变位点检测Figure 2. The sequencing results of mutant segment in npr1-2 plant2.2 纯合突变体npr1-2中NPR1基因的表达水平检测
通过利用荧光实时定量PCR对npr1-2纯合突变体植株中NPR1基因的表达量进行分析发现：突变体突变后，NPR1基因表达量明显下调(图4)。
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图 4 野生型和npr1-2突变体中NPR1基因表达量注：**表示差异性达1%极显著水平。Figure 4. Expression of NPR1 gene in wild type and npr1-2 mutant plantsNote: ** indicates significant difference at 1% level.2.3 突变体对水杨酸的敏感性试验
NPR1在植物系统获得性抗性诱导中发挥作用的分子机制目前比较清楚，NPR1蛋白被认为是水杨酸的受体，通过感受和调节水杨酸的信号转导来启动病程相关基因(PR)的转录[4, 6]。因此NPR1突变后，植株对水杨酸的敏感性降低。利用高浓度水杨酸会抑制拟南芥根生长的特性，本研究将拟南芥种子播种于含水杨酸的MS培养基上，观察拟南芥幼苗的根生长情况，以了解突变体对水杨酸的响应变化。将npr1-2纯合突变体和野生型种子播于含有28 μmol/L水杨酸的培养基上，20 d时观察到野生型幼苗生长受到严重抑制，而 npr1-2突变体幼苗的生长受抑程度显著低于野生型，即其根长明显长于野生型(图5，表1)。上述研究结果表明：npr1-2纯合突变体对水杨酸敏感性下降是由NPR1基因表达量下调引起的。
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图 5 野生型与npr1-2根对水杨酸的敏感性试验(Bar=1 cm)注：a) 野生型幼苗在不含SA的培养基上根生长情况； b) npr1-2幼苗在不含SA的培养基上根生长情况；c) npr1-2幼苗在含28 μmol/L SA的培养基上根生长情况；d) 野生型幼苗在含28 μmol/L SA的培养基上根生长情况。Figure 5. Response of wild type and npr1-2 seedlings to salicylic acid treatmentNote: a) root growth of WT seedlings on medium without SA; b) root growth of npr1-2 seedlings on medium without SA; c) root growth of npr1-2 seedlings on medium containing 28 μmol/L SA; d) root growth of WT seedlings on medium containing 28 μmol/L SA.表 1 水杨酸处理后野生型与npr1-2突变体根生长长度Table 1. Length of roots in wild type and npr1-2 mutant plants treated with salicylic acid植物类型plant type 处理treatment 根长度/cm length of roots 野生型wild-type 未处理untreated 3.448±0.566 a npr1-2突变体mutant of npr1-2 未处理untreated 3.137±0.664 ab 野生型wild-type 水杨酸处理treated with salicylic acid 0.802±0.035 Ac npr1-2突变体mutant of npr1-2 水杨酸处理treated with salicylic acid 1.731±0.050 BC 注：同列中不同小写字母表示差异性达5%显著水平；不同大写字母表示差异性达1%极显著水平。
Note: Different lowercases within the same column indicate significant difference at 5% level; different capital letters within the same column indicate significant difference at 1% level.3. 讨论
通过试验得到了拟南芥水杨酸信号转导缺陷突变npr1-2纯合植株，以此为材料，进行了实时荧光定量RT-PCR以及水杨酸敏感性鉴定实验，结果显示：纯合突变体npr1-2中NPR1基因表达量明显下调，并且突变体幼苗对水杨酸的敏感性显著降低。NPR1蛋白含有2个保守的蛋白-蛋白互作结构域，即N末端的BTB/POZ和中部的锚蛋白重复结构域，npr1-2突变发生在锚蛋白重复结构域中，使半胱氨酸(150氨基酸残基)突变为酪氨酸(400氨基酸)，导致无义密码子，产生丢失194个氨基酸C末端缺乏的水杨酸受体位点消失的截短蛋白[1]。CAO等[1]研究表明：npr1突变体具有对外施高浓度(5 mmol/L)水杨酸敏感的表型，认为是npr1突变体解毒功能下降所致，但没有呈现具体的实验结果。本研究将纯合的npr1-2突变体和野生型种子播种于含28 μmol/L 水杨酸的MS中，垂直培养20 d，发现水杨酸抑制了植物幼苗根的生长，但npr1-2幼苗根的受抑制程度明显低于野生型，我们推测npr1-2突变体对水杨酸感受的顿挫，导致其对较低浓度作为信号分子的水杨酸的敏感性降低。
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图 1 小麦胚乳淀粉粒体积、数量和表面积分布特征
Figure 1. The volume, number and surface area distributions of starch granule in wheat grains
表 1 追氮时期对小麦籽粒淀粉含量与积累量的影响
Table 1 Effect of nitrogen topdressing stages on the content and accumulation of starch in wheat grain
品种
cultivar氮素水平
nitrogen rate追氮时期
nitrogen topdressing stage千粒重/g
1 000-grain weight淀粉含量/%
starch content淀粉积累量/(mg·grain−1)
starch accumulation矮抗58
Aikang58 (A58)N1 RGS 42.25±1.31 d 69.71±0.12 ab 29.45±0.05 f JS 46.05±0.54 ab 69.59±0.07 b 32.04±0.03 a N2 RGS 45.07±0.61 abc 69.53±0.1 bc 31.33±0.04 b JS 46.29±0.42 a 69.23±0.15 d 32.05±0.07 a 山农22
Shannong22 (S22)N1 RGS 42.52±0.52 d 69.83±0.13 a 30.51±0.05 d JS 44.48±2.52 c 69.31±0.16 cd 30.92±0.07 c N2 RGS 43.69±0.85 cd 69.86±0.13 a 29.71±0.06 e JS 44.61±0.75 bc 69.59±0.19 b 30.95±0.08 c 注：RGS. 返青期；JS. 拔节期。同列不同小写字母表示5%水平差异显著；下同。
Note: RGS. returning green stage；JS. jointing stage. Different lowercase letters within the same columns mean significant difference at P=0.05; the same as below.
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表 2 追氮时期对小麦籽粒淀粉体积分布的影响
Table 2 Effect of nitrogen topdressing stages on the volume distribution of starch granule in wheat grain
品种
cultivar氮素水平
nitrogen rate追氮时期
nitrogen topdressing stage平均粒径/μm
average particle size不同淀粉粒组比例/%
percentage of starch granule in different sizes<2.8 μm 2.8~10 μm <10 μm $ \geqslant $ 10 μm
A58 N1 RGS 16.93±0.27 b 8.75±0.13 e 19.19±0.6 e 27.93±0.72 f 71.97±0.72 c JS 15.11±0.03 d 11.73±0.12 a 26.03±0.12 b 37.77±0.23 b 62.13±0.23 g N2 RGS 15.55±0.15 c 10.4±0.1 c 24.77±0.51 c 35.17±0.61 d 64.73±0.61 e JS 17.6±0.14 a 8.43±0.04 f 16.07±0.32 g 24.5±0.36 h 75.5±0.36 a S22 N1 RGS 15.45±0.10 c 10.09±0.12 d 22.24±0.46 d 32.33±0.57 e 67.64±0.55 d JS 14.07±0.07 e 11.73±0.23 a 28.27±0.21 a 40±0.44 a 59.99±0.44 h N2 RGS 14.89±0.11 d 11±0.1 b 25.5±0.40 b 36.5±0.46 c 63.47±0.46 f JS 16.77±0.23 b 8.57±0.17 ef 17.23±0.41 f 25.8±0.56 g 74.18±0.56 b
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表 3 不同追氮时期对小麦淀粉粒数量分布的影响
Table 3 Effect of nitrogen topdressing stages on the number distribution of starch granules in wheat grain
品种
cultivar氮素水平
nitrogen rate追氮时期
nitrogen topdressing stage不同淀粉粒组比例/% percentage of starch granule in different sizes <2.8 μm 2.8~10 μm <10 μm $ \geqslant $ 10 μm
A58 N1 RGS 97.97±0.06 a 1.93±0.06 c 99.9±0 a 0.1±0 a JS 97.03±0.06 c 2.87±0.06 a 99.9±0 a 0.1±0 a N2 RGS 97.4±0 b 2.5±0 b 99.9±0 a 0.1±0 a JS 96.87±0.06 c 2.9±0 a 99.9±0 a 0.1±0 a S22 N1 RGS 97.87±0.06 a 2.03±0.06 c 99.9±0 a 0.1±0 a JS 97.47±0.06 b 2.43±0.06 b 99.9±0 a 0.1±0 a N2 RGS 97.53±0.06 b 2.37±0.06 b 99.9±6 a 0.1±0 a JS 97.3±0.36 b 2.5±0.26 b 99.9±0.1 a 0.1±0 a
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表 4 追氮时期对小麦淀粉粒表面积分布的影响
Table 4 Effect of nitrogen topdressing stages on the surface area distribution of starch granules in wheat grain
品种
cultivar氮素水平
nitrogen rate追氮时期
nitrogen topdressing stage不同淀粉粒组比例/% percentage of starch granule in different sizes <2.8 μm 2.8~10 μm <10 μm $ \geqslant $ 10 μm
A58 N1 RGS 49.17±0.15 b 25.2±0.35 f 74.37±0.49 d 25.63±0.49 c JS 50.9±0.2 a 30.33±0.06 b 81.23±0.21 a 18.77±0.21 f N2 RGS 49.5±0.1 b 29.8±0.2 c 79.3±0.3 b 20.7±0.3 e JS 46.83±0.12 d 23.33±0.32 g 70.17±0.21 f 29.83±0.21 a S22 N1 RGS 50.83±0.06 a 26.53±0.29 e 77.37±0.32 c 22.63±0.32 d JS 51.07±0.38 a 30.9±0.1 a 81.97±0.29 a 18.03±0.29 f N2 RGS 50.77±0.12 a 29.33±0.25 d 80.1±0.26 b 19.9±0.26 e JS 47.87±1.32 c 23.4±0 g 71.27±1.32 e 28.73±1.32 b
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