云南蔓草虫豆丛枝植原体16S rDNA和secY基因序列分析
Analysis of the Sequences of 16S rDNA and secY of Cajanus scarabaeoides Witches’-broom Phytoplasma in Yuanmou, Yunnan Province
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Keywords:
- Cajanus scarabaeoides witches’-broom /
- phytoplasma /
- 16S rDNA /
- secY /
- sequence analysis
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繁育系统在影响植物表型和进化路线方面有着重要作用,主要包括花部形态性状、开放式样、交配系统、传粉者类别和传粉频率等,其中,交配系统可以控制植物种群数量以及种群遗传变异情况,在繁育系统中起着核心作用[1-2]。相关研究认为:植物繁育特性(如开花传粉、交配系统、种子散布方式和进化历史)对其遗传结构、遗传变异及分化和基因流等具有重要影响[3]。植物授粉系统随着环境和授粉条件的变化而变化,其繁育系统决定着植物的分布和扩散能力,也影响着植物的进化潜力。有效传粉是植物果实和种子结实的首要条件,决定着植物的生存潜力,其中有效传粉者起着关键作用[4]。了解繁育系统的生殖特性,对于分析极小种群野生植物致危原因以及生存于恶劣环境导致传粉受限的物种有着重要的作用[5]。
亚洲地区发现的杜鹃属(Rhododendron)植物多达900余种,且一半以上分布在中国;中国74%以上的杜鹃花为特有种,以云南、贵州和四川最为丰富,构成了杜鹃属植物的现代分布和演化中心[6-7]。有学者对极小种群野生植物杜鹃属的物种遗传多样性进行了研究,如宽杯杜鹃(R. sinofalconeri)[8]和红萼杜鹃(R. meddianum)[9]。近年来,杜鹃属植物繁育系统与环境关系的研究备受关注,大部分杜鹃花属植物的繁育系统倾向于异交的复合交配方式[10-14],而宽杯杜鹃[15]和长梗杜鹃(R. longipedicellatum)[16]的繁育系统为自交和异交的混合交配系统,但有关波叶杜鹃繁育系统的研究尚未见报道。
波叶杜鹃(R. hemsleyanum)是杜鹃属常绿灌木,花冠白色宽钟状,边缘波状,其分布海拔低,生长适应性强,有较高的观赏价值,是一种极具开发应用潜力的野生花卉资源。波叶杜鹃仅分布于四川峨眉山,该地处于旅游开发区,其野生资源受人为干扰严重,分布区域狭窄并多伴有人为建筑,生境破碎化,种群数量稀少。在《中国高等植物受威胁物种名录》[17]《中国生物多样性红色名录》[18]《IUCN 红色名录》[19]和《The Red List of Rhododendrons》[20]中,波叶杜鹃被评估为极度濒危物种。经过多次实地考察,课题组发现波叶杜鹃在峨眉山仅有6个分布单元,现存个体数163株,种群更新较弱,是典型的极小种群野生植物。本研究对四川峨眉山的野生波叶杜鹃资源现状进行深入调查,观察其花部形态和昆虫访花行为,结合杂交指数、花粉—胚珠比和人工控制授粉等试验揭示其繁育系统特征,并提出其有效合理的保护措施,为其作为乡土园林树种推广和极小种群杜鹃属植物资源的可持续利用提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区位于四川省峨眉山市峨眉山长老坪(N29º57′16.6′′,E103º36′63.9′′,海拔1 449 m)和石笋沟(N29º55′88.8′′ ,E103º37′11.1′′ ,海拔1 191 m)。该区为中亚热带季风气候,年均温17 ℃,年平均降水量1 555 mm,空气相对湿度达80%以上[21];坡度较陡;土壤多为黄壤和棕壤,少见黄棕壤[22]。波叶杜鹃群落结构复杂,伴生植物乔木层以樟科(Lauraceae)为主,伴有日本柳杉(Cryptomeria japonica)、鞘柄木(Torricellia tiliifolia)、杨叶木姜子(Litsea populifolia)和锐齿槭(Acer sikkimense),灌木层以柃属(Eurya)为主,伴有勾儿茶(Berchemia sinica)和箭竹(Fargesia spathacea)等植物[23]。
1.2 研究材料
供试波叶杜鹃为研究区生长的野生波叶杜鹃。
1.3 研究方法
1.3.1 花期物候与花部特征观察
2021年5—6月对峨眉山长老坪和石笋沟的波叶杜鹃野外居群进行群体花期物候观察。随机挑选波叶杜鹃10株记录其始花、终花以及花期持续时间和开花同步性;在波叶杜鹃花期随机挑选10株,每株均随机挂牌花序3个,每天观察和统计花序新增的开花数量和开放持续时间;在盛花期,观察并统计波叶杜鹃花部形态特征并随机挂牌花朵30朵,记录单花花期时间和形态变化,记录始花、终花时间及花期同步指数[24]。
$ {花}{期} {同}{步}{指}{数}=\dfrac{1}{N}\left(\dfrac{1}{{T}_{{\rm{K}}}}\right)\displaystyle\sum _{{\rm{J=K}}}^{N}{R}_{{\rm{J}}\ne {\rm{K}}}。 $
式中:花期同步指数范围为0~1;N为种群个体总数;TK为单个花期时间;RJ为个体K和个体J的花期重复时间。
1.3.2 花粉活力和柱头可授性检测
波叶杜鹃开花当日花粉活力测定:随机选取当日开花的单花15朵,从9: 00—21: 00每2 h取花粉1次,将其涂抹于载玻片,用5.0%蔗糖与0.5%氯化三苯基四氮唑(TTC)的混合液进行染色,放入培养皿(内置湿润滤纸),25 ℃、无光条件静置2 h,于显微镜下观察染色情况,重复3次。染色花粉数与观察花粉总数比值的百分数为波叶杜鹃的花粉活力值。
波叶杜鹃花期的花粉活力测定:标记花蕾期(主要指开花前1~2 d)和开花后1~8 d的花朵30朵,每天9: 00随机选取单花3朵测其花粉活力,重复3次。测定方法同开花当日花粉活力的测定。
波叶杜鹃开花过程中柱头可授性测定:每天11: 00随机选取花蕾期和开花后1~8 d的单花3朵,共选取30朵,参照DAFNI[25]的方法,将柱头置于凹面载玻片上,滴加反应液(V3%过氧化氢: V水: V 1%联苯胺 = 11∶22∶4)后观察柱头是否染色。根据颜色和气泡判定柱头的可授性,具体标准为:柱头接触反应液后无气泡和颜色出现,为不具有可授性,记为0;柱头接触反应液后产生1~6个气泡且未出现蓝色反应,为部分具有可授性,记为1;柱头1/2面积产生气泡且有微弱的蓝色反应出现,为具有可授性,记为2;柱头2/3面积产生大量气泡且蓝色加深,为可授性较强,记为3;整个柱头几乎都有气泡产生且有明显的蓝色反应,为可授性强,记为4。
1.3.3 估算杂交指数和花粉—胚珠比
于波叶杜鹃盛花期,随机挑选其花序30个(每株单株3个花序,共10株单株),观察其花部特征,参照DAFNI等[26]的标准(花冠直径、花部特征和柱头可授性)计算其杂交指数,并评估波叶杜鹃的繁育系统。
随机挂牌标记已开放但是花药还未开裂的花蕾30个(每株单株采集3个花序,共10株单株),将其采集到室内,待花药开裂后将其制作成花药悬浮液,于体式显微镜下观察并计数其花粉量。摘除波叶杜鹃花瓣、花萼、花冠和雄蕊,将子房在解剖镜下用解剖刀切开,找出胚珠,记录胚珠数。参照CRUDEN[27]的标准评估波叶杜鹃的繁育系统,即花粉—胚珠比为244.7~2 588.0时,繁育系统为兼性异交,花粉—胚珠比越小则近交程度越强,花粉—胚珠比越大则远交程度越强。
1.3.4 授粉方式研究
选取峨眉山长老坪的波叶杜鹃开花植株,根据TAMURA等[28]的方法对其进行6种不同授粉方式的处理:(1)未开花前去雄蕊,套硫酸纸袋处理(孤雌生殖);(2)花蕾期去雄蕊,不套任何袋(传粉媒介介导的异花授粉);(3)整个单花花期套网袋(自花授粉);(4)花蕾期去雄蕊并套硫酸纸袋,开花到第3 天时用同株但不同花的花粉授粉并套硫酸纸袋(同株异花授粉);(5)花蕾期去雄套袋,第3 天使用间隔一定距离(10 m)且单花开放的植株花粉授粉,授粉完成后套袋(异株异花授粉);(6)自然对照。所有处理挂牌标记,种子成熟时统计结实率。结实率=成熟果实数/处理花朵数×100%。
1.3.5 访花昆虫及其行为观察
2021年5月中旬(波叶杜鹃盛花期)进行连续3 d访花昆虫观察,记录访花昆虫种类、数量和行为等。用捕虫网收集访花昆虫并置于75%酒精中保存,用于后续鉴定。根据STOUT[29]判定有效访花昆虫的标准(即具有携带花粉的能力又能触碰柱头的昆虫),明确波叶杜鹃的有效传粉者。
2. 结果与分析
2.1 花期物候与花部特征
波叶杜鹃为顶生总状伞形花序,每个花序花朵数7~16朵,花朵展示醒目。波叶杜鹃5月初始花出现,5月中旬为盛花期, 6月初花期结束,单花开花6~10 d,单花开放进程可划分为花蕾期、盛花期和凋谢期(图1)。单株开花同步性较高,花期同步指数为0.72±0.31,呈多峰曲线式开花进程,开花数量于始花出现后第6天达到峰值(图2)。
波叶杜鹃花冠呈白色宽钟状,直径30.17~76.47 mm,7裂,裂片扁圆形,顶端有缺刻;雄蕊不等长,平均14~16 mm,花药白色长椭圆形。波叶杜鹃花部主要形态指标见表1。花蕾期时,波叶杜鹃柱头被花瓣包裹,花朵顶部淡红,剖开花朵后发现柱头白色未成熟,柱头未分泌黏液;盛花期时,花瓣变为白色,完全打开,柱头弯曲呈拱形,有黏液,雄蕊和雌蕊分离;凋谢期时,花瓣边缘卷曲呈褐色,柱头颜色逐渐变为褐色,有黏液。
表 1 波叶杜鹃花部特征Table 1. Floral syndrome of Rhododendron hemsleyanum指标
indexes最小值
minimum最大值
maximum平均值
mean标准差
standard deviation变异系数/%
coefficient of variation花瓣长/mm petal length 16.11 28.57 23.54 2.59 11.00 花瓣宽 /mm petal width 15.59 24.01 18.11 3.14 17.33 花冠直径/mm flower diameter 30.17 76.47 43.05 4.11 9.55 柱头宽 /mm stigma diameter 3.01 4.79 4.34 0.92 21.20 花柱长/mm style length 39.34 52.07 45.29 3.79 8.37 花梗长/mm pedicel length 26.55 46.59 34.31 4.17 12.15 花丝长/mm filament length 19.17 28.03 24.59 4.77 19.40 花萼长/mm calyx length 1.12 1.76 1.47 0.74 50.34 花药长/mm anther length 2.87 4.52 3.62 1.01 27.90 子房长/mm ovary length 6.21 8.27 7.14 3.14 44.00 子房宽/mm ovary width 4.14 7.69 5.29 1.02 19.28 柱头与花药最短距离/mm
shortest distance of stigma to anthers16.74 41.20 28.43 3.57 12.56 2.2 花粉活力及柱头可授性
由图3可知:开花当天,波叶杜鹃的花粉活力在11: 00最高(90.25%),之后呈逐渐降低趋势,17: 00时最低(48.67%),之后缓慢上升;花蕾期的花粉活力为87.11%,随着花朵开放和花药开裂,花粉活力上升,花粉活力在开花第1天最大(91.05%),之后花粉活力逐日下降,花药和柱头颜色逐渐变黑,随着花粉散出其活力逐渐下降,至凋谢期时(花期第9~10天)花粉活力仍保持在约30%,可见,自然状态下波叶杜鹃能长期保持较高的花粉活力。此外,在花期第1和2天时,波叶杜鹃柱头不产生黏液,未出现呈蓝色的颜色反应,不具有可授性;在开花后3~7 d,柱头与反应液反应逐渐剧烈,蓝色逐渐明显,气泡增多;在第6和7 天柱头与反应液反应剧烈,柱头产生气泡最多,可授性最强;在第8和9天柱头与反应液反应逐渐减弱,蓝色变浅的同时气泡变少;开花第10天,野外观察到波叶杜鹃花瓣和雄蕊开始脱落,柱头可授性结果显示无颜色反应和未产生气泡,此时波叶杜鹃失去柱头可授性。
2.3 杂交指数与花粉—胚珠比
按照DAFNI等 [26]的标准估算波叶杜鹃杂交指数。波叶杜鹃花冠直径为(43.05±4.11) mm>6 mm,记为3;其同时具有雌蕊和雄蕊,其中雄蕊先熟,记为1;开花时柱头弯曲且位置高于花药,产生空间分离现象,记为1。因此,波叶杜鹃杂交指数为3+1+1=5,可推断波叶杜鹃繁育系统部分自交亲和。
波叶杜鹃单花花粉数量为416 289±5 125.71,单花胚珠数量为649.51±67.45,因此,其花粉—胚珠比为640.93±65.52,根据CRUDEN[27]对繁育系统的评判标准,判断波叶杜鹃繁育系统为兼性异交。
2.4 不同授粉方式对波叶杜鹃结实率影响
由表2可知:自然对照组果实17个,结实率56.67%,说明波叶杜鹃能在峨眉山野生居群下自然结实,但结实率较差;去雄套袋果实数和结实率均为0,说明波叶杜鹃不存在孤雌生殖现象;去雄不套袋果实数和结实率均略低于自然对照组,说明波叶杜鹃可以在虫媒帮助下授粉结实,且基本能达到自然条件下的结实率;自花授粉能产生2个果实,结实率为6.67%,判断波叶杜鹃能通过自交结实,具有一定程度的自交亲和性;异株异花授粉和同株异花授粉的果实数和结实率均明显高于自然对照组,进一步说明波叶杜鹃异交传粉机制有效,主要以异交为主,其结实受传粉者限制。
表 2 不同授粉方式处理后波叶杜鹃的结实率Table 2. Fruit set of R. hemsleyanum under different pollination treatments授粉方式
pollination treatments花序数量
number of inflorescences授粉花数量
number of flowers果实数量
number of fruits结实率/%
fruit set自然对照 natural pollination 10 30 17 56.67 去雄套袋 emasculated and bagged 10 30 0 0 去雄不套袋 emasculation is not bagged 10 30 15 50.00 自花授粉 autonomous self-fertilization 10 30 2 6.67 同株异花授粉 strains cross-pollination 10 30 23 76.67 异株异花授粉 different strains cross-pollination 10 30 26 86.67 2.5 访花昆虫及其行为
波叶杜鹃访花昆虫主要包括蜜蜂科(Apidae)、蚁科(Formicidae)、食蚜蝇科(Syrphidae)和蚜总科(Aphidoidea) (表3)。
表 3 波叶杜鹃访花昆虫Table 3. Flower visiting insects of R. hemsleyanum目
order科
family种
species是否为有效传粉者
effective pollinator or not膜翅目 Hymenoptera 蜜蜂科 Apidae 中华蜜蜂 A. cerana 是 yes 排蜂 A. dorsata 是 yes 蚁科 Formicidae 蚁科某种 Formicidae sp. 否 no 双翅目 Diptera 食蚜蝇科 Syrphidae 灰带管蚜蝇 Eristalis cerealis 否 no 黑带食蚜蝇 Episyphus balteatus 否 no 同翅目 Homoptera 蚜总科 Aphidoidea 蚜总科某种 Aphidoidea sp. 否 no 中华蜜蜂访花前先在空中盘旋,之后停留在某一植株上访花,落到波叶杜鹃花冠上时头部伸入花腔内,通过其细长的口器吸食花蜜或花粉,转动身体,后足更换着力点,行动较为缓慢,在同一朵花上停留数分钟,在此过程中身体沾到大量花粉,能有效地为波叶杜鹃传粉(图4a~c)。排蜂靠近波叶杜鹃花朵时,悬空震动翅膀,前足先接触花冠,然后采粉,随之晃动使得花粉粘在其头部和身体上,用其足部刮刷,将花粉聚集到其花粉筐中(图4d~f);当排蜂进入另一朵花时,就将其携带的花粉授到柱头上,能有效地为波叶杜鹃传粉。而黑带食蚜蝇(Episyphus balteatus) 、蓟马(Thrips)和蚂蚁等小型的昆虫主要以盗取花蜜为主,身体各部均不携带花粉且不接触柱头。因此,判定波叶杜鹃白天的有效传粉者是中华蜜蜂和排蜂。此外,观察发现传粉者的传粉活动可能受自然因素的影响较大,波叶杜鹃开花时期,温度较高且天气晴朗的时候访花者频率较高,主要是由于波叶杜鹃花朵展示醒目并散发芳香味道,吸引传粉者;而盛花期时阴雨天较多,空气湿度低,温度较低,影响访花者活动频率。
3. 讨论
3.1 波叶杜鹃花粉活力及花部特征
本研究中,波叶杜鹃花冠为大型花冠,开花呈伞形花序,开花时花朵白色,花香浓郁,花瓣不折叠,开花量较大且同步较高,具有蜜腺,增加花展示面积的同时可吸引中华蜜蜂和排蜂传粉。开花式样通过吸引传粉者影响花粉散布方式,进而影响植物的交配系统[30]。波叶杜鹃雄蕊和雌蕊成熟时期不同,根据观察发现其雄蕊先熟;其花粉活力在开花当天11: 00达到峰值(90.27%),低于宽杯杜鹃 (花粉活力最高达92.80%)[15]和长梗杜鹃 (花粉活力最高达92.18%)[31],高于锈叶杜鹃 (R. siderophyllum,花粉活力最高达83.95%)[13]和大喇叭杜鹃 (R. excellens,花粉活力最高达84.43%)[14]。波叶杜鹃花粉活力保持在50%以上的时间有7 d,花朵开放时期的花粉活力均在40%以上,推断波叶杜鹃具有大量花粉及高效保持花粉活力的机制以保证其传粉成功。凋谢期时,波叶杜鹃的花粉活力仍可保持在29%以上,推断这可能是由于盛花期未成熟花粉逐渐成熟并累积到凋谢期所致。
本研究表明:波叶杜鹃柱头可授性最强时,花粉活力仍保持在40%以上;野外观察发现:雄蕊和雌蕊有一段短暂的同时期表达时段,但该时期波叶杜鹃花柱弯曲呈拱形,花柱悬垂,导致雄蕊和雌蕊产生空间异位现象,根据自花授粉结果,推断雌雄异位现象有效避免了自花传粉的可能性。两性植物保证异交成功的花部特征是花朵雌雄异位现象,可以避免自交和有性功能干扰的机制[32-33];同时波叶杜鹃花柱的悬垂形状还有效避免了雨水对柱头花粉和表面黏液的冲刷,这与前人研究结果[34-35]一致。开展遗传育种时,作为父本的波叶杜鹃花粉活力在开花当天11: 00达到最高值,此时采集花粉进行人工授粉试验可能最为有利。
3.2 波叶杜鹃繁育系统和授粉方式
根据DAFNI等[26]和CRUDEN[27]的划分标准,波叶杜鹃繁育系统类型为兼性异交,且自然条件下其结实率达56.67%。然而,在野生居群中极少发现波叶杜鹃实生苗,说明该物种存在自然更新障碍,这可能与其生境土层浅薄和郁闭度高等立地条件导致的种子萌发困难有关。FREE[36]和READER[37]研究表明大多数杜鹃花科植物都具有自交亲和性,波叶杜鹃自花授粉结实率6.67%,判断其能通过自交结实。野外调查发现:波叶杜鹃在开花第3~7天时花药逐渐散落且花粉呈线状;开花第8~10天,花冠开始枯萎下垂,花托开始与基部分离,导致花瓣和雄蕊向花柱偏移,花粉黏附在花柱上实现部分自交,故判断波叶杜鹃具有一定程度的自交亲和性,与马雄杜鹃 (R. maxiongense)[12]、锈叶杜鹃[13]和大喇叭杜鹃[14]的繁育系统一致。本研究推断波叶杜鹃繁育系统由自交向异交演化的可能性较大,因为波叶杜鹃同长梗杜鹃[31]、牛皮杜鹃 (R. aureum)[38]等大部分杜鹃花一样进化出柱头呈拱形悬垂状的特征,通过雄蕊和雌蕊空间异位避免自花授粉现象。波叶杜鹃分布在陡壁悬崖边和沟谷地,种间距离较远,传粉媒介较为缺乏,异交受到限制,部分自交亲和可能是为适应群落特征而产生的补偿作用。频繁的远交和近交都会导致其繁育系统适合度下降,因此,最适合的交配方式是实现适度的杂交[39],波叶杜鹃的花药和柱头在空间上异位,这将大大降低自花授粉,防止自交衰退,增强子代的适应能力。本研究认为波叶杜鹃部分自交亲和,这与LEE等[40]的观点一致,即:起源于较小奠基者种群的物种,在分布区域狭窄、生境破碎化和种群数量较小时,为了种群繁育经常会发生近交现象。自交物种的环境适应能力及形成新种的潜力较弱,自交不适宜作为长期生殖策略[41]。将波叶杜鹃选作母本时,其柱头可授性在花朵开花后第6和7天最强,此时通过人工异花授粉的方式可提高波叶杜鹃自然条件下异交的概率,促进不同种群间的基因交流。
3.3 访花昆虫
国内已报道大喇叭杜鹃[14]、长梗杜鹃[16]和大叶金顶杜鹃(R. prattii Franch.)[42]的有效传粉昆虫分别为中华蜜蜂、熊蜂和食蚜蝇类。本研究中,波叶杜鹃白天的主要访花者为中华蜜蜂和排蜂,且中华蜜蜂访问对象偏向初开期花朵,此时花粉活力强且散出量大,能保证传粉的时效性。蜜蜂访问频次可能与其耐热性、耐寒性、抗逆性和花粉传递效率等相关[43]。日间蝴蝶并没有访问过波叶杜鹃,这种差异可能是由于生境的环境气候条件所致[44]。据观察,蓟马和蚂蚁等小型的昆虫主要盗取花蜜,根据BASNETT等[39]提出“盗蜜者和传粉者授粉能力可能相同”的观点,推测蓟马和蚂蚁盗取花蜜的行为可能有利于波叶杜鹃花部特征的进化。HUANG等[45]研究表明:白色芳香杜鹃花的日间传粉者主要是蜜蜂和蝴蝶,夜间则会吸引蛾类授粉者。然而,由于夜间环境条件恶劣加之分布地紧邻悬崖峭壁,未开展夜间传粉观察,未来有条件需开展波叶杜鹃夜间有效传粉者的观察研究。在通过人工繁育等方法扩大波叶杜鹃群体数量的同时,应在花期结合释放有效访花昆虫的方式,全面提高波叶杜鹃在自然条件下的异交结实率。
4. 结论
波叶杜鹃繁育系统是倾向于异交的混合交配系统,自然条件下有效传粉者为中华蜜蜂和排蜂。波叶杜鹃花部特征表现出对虫媒传粉的适应性,在单株和群体水平上波叶杜鹃具有较高的开花同步性,可吸引较多访花者,产生较高的结实率,其雄蕊和雌蕊的空间异位可在一定程度上避免自交。波叶杜鹃野生分布地处于旅游开发区,受人为干扰程度较强,可通过人工繁育等方式扩大其种群,也可在花期释放有效昆虫等提高其自然条件下异交的概率。
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图 2 蔓草虫豆丛枝病16S rDNA、secY基因PCR电泳检测结果
注:a) 16S rDNA 直接 PCR 产物;b) 16S rDNA 巢式 PCR 产物;c) secY 巢式 PCR 产物。M. DL-2000 Marker;1. 阳性对照;2. 双蒸水阴性对照;3~6. 感病蔓草虫豆样品。
Figure 2. PCR products of 16S rDNA and secY gene from C. scarabaeoides witchs’-broom disease plants
Note: a) direct PCR products of 16S rDNA; b) nested PCR products of 16S rDNA; c) nested PCR products of secY. M. DL-2000 Marker; 1. positive control; 2. ddH2O negative control; 3-6. diseased C. scarabaeoides plants.
图 3 CaSWB-YNym3植原体的16S rDNA F2n/R2序列虚拟RFLP分析
注:a) 17种限制性内切酶的虚拟RFLP图谱;b)和c)限制性内切酶 TaqI和MseI的RFLP图谱。
Figure 3. Virtual RFLP analysis of CaSWB-YNym phytoplasma 16S rDNA F2n/R2 fragments
Note: a) virtual RFLP profile generated from in silico digestion of CaSWB-YNym with 17 restriction enzymes; b) and c) restriction enzymes TaqI and MseI produce unique RFLP patterns.
图 4 基于16S rDNA、secY基因核苷酸序列构建的的系统发育树
注:a) 基于16S rDNA基因核苷酸序列构建的蔓草虫豆丛枝植原体和16SrII组植原体株系的系统发育树;b) 基于secY基因核苷酸序列构建的蔓草虫豆丛枝植原体和相关植原体株系的系统发育树。
Figure 4. Phylogenetic trees based on 16S rDNA secY gene sequences
Note: a) phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences from C. scarabaeoides witches’-broom and 16S rII phytoplasma strains; b) phylogenetic tree based on secY gene sequences from C. scarabaeoides witches’-broom and related strains of phytoplasma.
表 2 PCR技术扩增16S rDNA、secY基因的反应体系和反应条件
Table 2 PCR reaction system and conditions for the amplification the 16S rDNA and secY genes
基因
gene反应体系(25 μL)
reaction system直接PCR反应条件
direct PCR reaction conditions巢式PCR反应条件
nested PCR reaction conditions16S rDNA,
secY10×EasyTaq Buffer 2.5 μL 预变性:94 ℃ 5 min 预变性:94 ℃ 5 min 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL 变性:94 ℃ 1 min $\Biggr\}$ 30个循环变性:94 ℃ 30 s $\Biggr\}$ 35个循环EasyTaq DNA polymerase 0.25 μL 退火:48 ℃ 1 min 退火:55 ℃ 60 s primers 各1 μL 延伸:72 ℃ 2 min 延伸:72 ℃ 90 s template DNA 1 μL 补平:72 ℃ 10 min 补平:72 ℃ 10 min ddH2O 17.25 μL 表 1 PCR扩增的引物序列
Table 1 Primers for PCR
基因gene 引物primer pair 预期PCR产物大小/bp expected size of PCR product 序列(5′→3′) sequence 16S rDNA P1 1 800 AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT P7 CGTCCTTCATCGGCTCTT R16F2n 1 200 GAAACGACTGCTAAGACT R16R2 TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG secY L15F1 2 200 CCTGGTAGTGGYAMTGGWAAAAC MapR1 ATTARRAATATARGGYTCTTCRTG SecYF2(II) 1 700 TGAAGGTGGTCAAACTCCT SecYR1(II) CCTGCCATTTTCATTATAGCG 表 3 植原体各株系16S rRNA、secY基因及secY编码氨基酸的序列登录号
Table 3 The accession No. of 16S rRNA, secY gene sequences and secY deducing amino acid sequences of phytoplasma strain
植原体病害及相关菌株
phytoplasma disease and strain地理来源
geographical origin16S rRNA基因的RFLP分类
16S rRNA gene RFLP classificationGenBank登录号
GenBank accession No.16S rRNA secY amino acid Peanut witches’-broom, PnWB-YNym Yunnan, China 16SrII-A JX871467 JX871468 AFZ89025 Cowpea phyllody, CoVP-YNym Yunnan, China 16SrII-A KC953001 KC953013 AGT17661 Cauliflower phyllody, CauWB-YNym Yunnan, China 16SrII-A KC953000 KC953012 AGT17658 Parthenium weed witches’-broom, ParVP-YNym Yunnan, China 16SrII-A KC953002 KC953014 AGT17664 Tomato big bud, TBB-YNym Yunnan, China 16SrII-A KC953004 KC953016 AGT17670 Tomato witches’-broom, TWB-YNym Yunnan, China 16SrII-A KC953005 KC953017 AGT17674 Sword bean witches’-broom, SBWB-YNym Yunnan, China 16SrII-A KC953003 KC953015 AGT17667 Sesame phyllody, SEPN Thailand, China 16SrII-A EF193357 GU004362 ADO33883 Black gram witches’-broom Myanmar 16SrII-A AB690304 — — Aster virescence Myanmar 16SrII-A AB690303 — — Alfalfa witches’-broom Oman 16SrII-A AB259169 — — Shaggy button witches’-broom Myanmar 16SrII-A AB690307 — — Lime witches’-broom, LWB Oman 16SrII-B EF186828 — — Crotalaria phyllody, CrP Thailand 16SrII-C EF193355 GU004349 ADO33853 Cotton phyllody, CoP Unknown 16SrII-C EF186827 GU004350 ADO33855 Tomato big bud, TBB Australia 16SrII-D EF193359 GU004347 ADO33849 Picris echioides Phyllody, PEP Italy 16SrII-E Y16393 GU004348 ADO33851 Italian alfalfa witches’-broom, IAWB Italy 16SrII-E EF193356 — — Cactus witches’-broom, CaWBYN11 Yunnan, China 16SrII-F EU099556 — — Cactus witches’-broom, CaWBYN23 Yunnan, China 16SrII-G EU099568 — — Cactus witches’-broom, CaWBYN24 Yunnan, China 16SrII-H EU099569 — — Cactus witches’-broom, CaWBYN06 Yunnan, China 16SrII-I EU099551 — — Cactus witches’-broom, CaWBYN07 Yunnan, China 16SrII-J EU099552 — — Cactus witches’-broom, CaWBYN28 Yunnan, China 16SrII-K EU099572 — — Cactus witches’-broom, CaWBYN01 Yunnan, China 16SrII-L EU099546 — — Aster yellows, BB Arkansas, USA 16SrI-A — AY803178 AAV73937 Peach X-disease, CX Canada 16SrIII-A — GU004327 ADO33782 Coconut lethal yellows, LYF Florida, USA 16SrIV-A — GU004320 ADO33761 Elm yellows, EY1 New York, USA 16SrV-A — GU004330 ADO33791 Clover phyllody, CP Canada 16SrVI-A — GU004315 ADO33746 Ash yellows, AshY1 New York, USA 16SrVII-A — GU004329 ADO33788 Loofah witches’-broom, LfWB Taiwan, China 16SrVIIIA — GU004319 ADO33758 Apple proliferation, AP15 Italy 16SrX-A X68375 GU004335 ADO33806 Stolbur-It, PTV Italy 16SrXII-A — GU004355 ADO33865 Mexico Periwinkle virescence, MPV Mexico 16SrXIIIA — GU004336 ADO33809 表 4 CaSWB-YNym3 16S rRNA、CaSWB-YNym1 secY 基因核苷酸序列及secY蛋白氨基酸序列与部分16SrII亚组株系的同源性分析
Table 4 Homology analysis of nucleotide sequences between CaSWB-YNym3 16S rRNA,CaSWB-YNym1 secY gene and its amino acid sequence with other phytoplasma strains of 16SrII subgroup
植原体株系phytoplasma strain 亚组subgroup 16S rDNA核苷酸 同源性/%
16S rDNA nucleotide homologousSecY 核苷酸同源性/%
nucleotide homologous氨基酸同源性/%
amino acid homologousPnWB-YNym 16SrII-A 100.00 99.59 99.50 CoVP-YNym 16SrII-A 99.89 99.71 99.80 CauWB-YNym 16SrII-A 99.94 99.77 99.80 ParVP-YNym 16SrII-A 100.00 99.65 99.30 TBB-YNym 16SrII-A 100.00 99.71 99.50 TWB-YNym 16SrII-A 100.00 99.53 99.50 SBWB-YNym 16SrII-A 100.00 99.77 99.80 SEPN 16SrII-A 99.80 99.63 99.50 CrP 16SrII-C 98.49 88.26 85.00 CoP 16SrII-C 98.62 88.29 84.50 TBB 16SrII-D 99.80 99.57 99.30 PEP 16SrII-E 98.13 88.47 86.20 -
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