细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)是一种由基因控制的细胞自主而有序的死亡行为，其过程受细胞内外多种信号系统的诱导，并受细胞内部多种信号转导因子级联反应的调控^[1-2]。Ca²⁺是真核细胞信号转导的核心组分之一，在细胞PCD过程中具有诱导、启动和调节等十分重要的作用^[3-10]。目前有关Ca²⁺与植物PCD的相关研究发现，Ca²⁺作为第二信使调控着植物PCD的信号转导过程^[11]。一些外界信号，如IAA、Eth、CTK等第一信使经其受体进行一系列跨膜信号转换后，调节Ca²⁺的分布以及在特定部位含量瞬间变化而产生细胞内Ca²⁺信号，Ca²⁺信号再调节或激活其他PCD相关因子，进而影响着细胞PCD过程中一系列的生理生化反应以致形态学的变化^{[8, 11]}。显然，在植物PCD过程中，细胞内Ca²⁺的分布与转移即“时空性” 是形成Ca²⁺信号的基础^{[2, 12]}。

为解析Ca²⁺信号对植物不同部位PCD过程的调控关系，人们分别对不同植物的不同器官、组织PCD过程中的Ca²⁺分布的时空变化进行了较多的研究^{[7-8, 13-14]}，但至今未见有关木本植物芽体PCD过程中Ca²⁺分布的时空变化研究。我们首次发现：替码板栗枝条上的前段芽体可发生PCD导致枝条前段自然衰亡，使其树体在栽培上具有自然控冠、修剪省工的独特优势，并将替码板栗芽体PCD过程划分为5个特征明显时期(S1~S5)，前4个时期(S1~S4)芽体组织内Ca²⁺浓度高于非替码板栗^[1]，说明Ca²⁺参与替码板栗芽体PCD过程。但是，Ca²⁺在替码板栗芽体内部分布的时空动态变化及其对PCD过程的调节关系未知。因此，在已有研究的基础上，我们在替码板栗芽体发生PCD时期，利用焦锑酸盐沉淀技术在芽体细胞超微结构水平上研究Ca²⁺分布的时空变化，对比同期Ca²⁺在非替码板栗芽体内的分布差异，探讨Ca²⁺信号与芽体PCD过程间的关系，以期揭示替码板栗芽体完整的PCD信号转导途径及胞内级联反应，为人为调控板栗芽体PCD提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

试验地位于河北省农林科学院昌黎果树研究所板栗种质资源圃，栗园土质为砾质沙壤土，株行距4 m×4 m，常规管理水平。选用树龄均为10年生的树体健壮、生长正常、无病虫害的替码板栗品种X12和非替码板栗品种大板红为试验对象，每株树分东南西北4个方向随机采集树冠外围结果枝上部芽体50个作为1个试验样品，5次重复，样品釆集按照雄花脱落后20 d (S1时期)、25 d (S2时期)、30 d (S3时期)、35 d (S4时期)、40 d (S5时期) 5个时期进行^[15]。

1.2   方法

按照焦锑酸钾沉淀法制样^[14]。样品在Leica EM-UC6超薄切片机上用钻石刀切片，切片厚度为70 nm，不染色，采用透射电镜(日立，H-7 500)观察，CCD数码相机(Gatan 832)拍照。

每种材料的超微定位至少观察10个视野，选取典型区域进行拍照。对照样品的切片置于100 mmol/L (pH 7.8)的EGTA中37 °C孵育2 h，然后观察拍照。

2.   结果与分析

2.1   S1时期X12芽体Ca²⁺超微细胞化学定位

S1时期，替码板栗X12和非替码板栗大板红芽体细胞骨架结构正常，细胞壁清晰；质膜结构完整；细胞核结构完整，核膜双膜结构明显，核仁清晰；液泡膜结构完整，清晰(图1a、b；图2a)。

图  1  替码板栗X12 S1~S5时期内芽体细胞Ca²⁺的分布

注：a)~l)中的黑色颗粒(箭头所示)是显示Ca²⁺存在的焦锑酸钙沉淀；a) S1时期：Ca²⁺主要分布在细胞间隙和细胞壁处，液泡膜附近有较多Ca²⁺分布，细胞质和细胞核内有少量Ca²⁺颗粒，液泡内没有Ca²⁺颗粒；b) S1时期：内质网上有较多Ca²⁺；c) S2时期：细胞间隙中的Ca²⁺分布较少，较少Ca²⁺颗粒沿着细胞壁排列，细胞质中分布着较多Ca²⁺，沿着核膜分布着整齐的1圈Ca²⁺颗粒，细胞核内有少量Ca²⁺分布；d) S2时期：液泡膜附近，及解体的液泡内有大量Ca²⁺的分布；e) S3时期：细胞间隙和细胞壁上Ca²⁺颗粒较少，细胞质中的Ca²⁺分布很多；f) S3时期：质膜和胞间连丝处有大量Ca²⁺颗粒，液泡膜和细胞核膜附近有大量的Ca²⁺；g) S4时期：细胞壁上无Ca²⁺颗粒；h) S4时期：Ca²⁺呈无规则分布，主要集中在液泡碎片处；i)、j) S5时期：Ca²⁺随降解的细胞器碎片成块状聚集；k)、l)：切片经EGTA处理后，箭头所示Ca²⁺被螯合后的空洞，Ca²⁺沉淀颗粒被消除。N．细胞核；Nu. 核仁；Cw. 细胞壁；Re. 内质网；Pm. 质膜；Vm. 液泡膜；V. 液泡。

Figure  1.  Ca²⁺ distribution of the buds cell at five stage of apical-bud-senescence chestnut X12

Note: The black particles (arrowhead) in a)-j) are the calcium antimonite precipitate which shows calcium’s distribution. a) during the S1 period: there were a great amount of calcium particles in the intercellular space or on the cell wall, some calcium particles near the tonoplast, less calcium particles in the cytoplasm and the nucleus, no calcium particles in the vacuole; b) during the S1 period: many calcium particles on the endoplasmic reticulum; c) during the S2 period: Less calcium particles in the intercellular space, less calcium particles were arranged along the cell wall，many calcium particles in the cytoplasm, a neat circle of calcium particles is distributed along the nuclear membrane, less calcium particles in the nuclear; d) during the S2 period: many calcium particles near the tonoplast, and in the disassembled vacuole; e) during the S3 period: less calcium particles in the intercellular space or on the cell, and more in the cytoplasm; f) during the S3 period: there were a great amount of calcium particles on the plasma membrane and the plasmodesmata, and many calcium particles near the tonoplast and nuclear membrane; g) during the S4 period: there were almost no calcium particles on the cell wall; h) during the S4 period: calcium particles were randomly distributed at the vacuole debris; i) and j) during the S5 period: dalcium particles aggregated with degraded organelle fragments; k) and l) after the slices were treated with EGTA, the arrows showed the cavity of calcium sequestered by EGTA and the calcium precipitate particles were eliminated. N. nucleus; Nu. nucleolus; Cw. cell wall; Re. endoplasmic reticulum；Pm. plasmalemma; Vm. tonoplast; V. vacuole.

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图  2  非替码板栗大板红S1~S5时期内芽体Ca²⁺的分布

注：a) S1时期：Ca²⁺主要分布在细胞壁上，沿着细胞壁紧密整齐地排列1圈；b) S2时期：细胞间隙中有很多Ca²⁺呈黑色小颗粒状分散存在；c) S3时期：内质网上有很多Ca²⁺颗粒分布，细胞核内有少量Ca²⁺颗粒分布；d) S4时期：细胞质内存在少量Ca²⁺颗粒；e) S5时期：液泡内几乎检测不到Ca²⁺存在。N. 细胞核；Nu. 核仁；Cw. 细胞壁；Re. 内质网；Pm. 质膜；Vm. 液泡膜；V. 液泡 ；Chl. 叶绿体

Figure  2.  Ca²⁺ distribution of the buds cell at five stage of no-replaceable bud chestnut Dabanhong

Note: a) during the S1 period: there were a great amount of calcium particles were arranged along the cell wall; b) during the S2 period: there were a great amount of calcium particles were small and scattered within the intercellular space; c) during the S3 period: many calcium particles on the endoplasmic reticulum, and less in the nucleus; d) during the S4 period: there were a few of calcium particles in the cytoplasm; e) during the S5 period: there was almost no calcium particles in the vacuole. N. nucleus；Nu. nucleolus; Cw. cell wall; Re. endoplasmic reticulum; Pm. plasmalemma; Vm. tonoplast; V. vacuole; Chl. chloroplast

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这一时期，替码板栗X12和非替码板栗大板红的Ca²⁺分布差异不大，Ca²⁺均主要分布在细胞间隙和细胞壁处。Ca²⁺呈黑色小颗粒状分散存在于细胞间隙中，或沿着细胞壁紧密整齐地排列一圈；内质网上也均有较多Ca²⁺颗粒分布；质膜和液泡膜附近也有较多Ca²⁺分布，但质膜附近Ca²⁺沉淀颗粒比液泡膜附近多；另外，细胞质和细胞核内也有少量Ca²⁺颗粒均匀存在；液泡内几乎检测不到Ca²⁺存在(图1a、b；图2a)。

将样品用Ca²⁺的专一性螯合剂EGTA处理后在透射电镜下观察，发现应该有焦锑酸钙沉淀颗粒的部位变成空洞(图1k、l)，这说明Ca²⁺沉淀颗粒被消除，本研究中Ca²⁺的定位是可靠的。

2.2   S2时期X12芽体Ca²⁺超微细胞化学定位

S2时期，非替码板栗大板红细胞骨架结构正常(图2b)，替码板栗X12芽体细胞的细胞壁清晰，质膜结构完整，但液泡和细胞核变化较为明显，其中，液泡体积变大，个别液泡膜部分位置破裂变得不完整；细胞核体积变小，核仁变模糊(图1c、d)。

与S1时期相比，非替码板栗大板红的Ca²⁺分布没有明显变化(图2b)。替码板栗X12 芽体细胞内质网上Ca²⁺的分布变化不明显，但其他部位Ca²⁺的分布发生了变化：细胞间隙中的Ca²⁺分布减少，Ca²⁺沉淀颗粒仅沿着细胞壁排列；细胞质中Ca²⁺分布开始增多，在细胞质膜附近均匀分布着较多Ca²⁺沉淀颗粒；液泡膜附近开始出现大量Ca²⁺沉淀颗粒，部分解体的液泡内有大量Ca²⁺的分布；细胞核膜附近Ca²⁺颗粒也增加，沿着核膜分布着整齐的1圈Ca²⁺沉淀颗粒，细胞核内也有少量Ca²⁺分布(图1c、d)。

2.3   S3时期X12芽体Ca²⁺超微细胞化学定位

S3时期，非替码板栗大板红细胞骨架结构仍保持正常(图2c)，而替码板栗X12细胞结构进一步解体，细胞形状变得不规则，部分细胞壁出现断裂；液泡数量增多，液泡膜边界变得模糊，而且大部分液泡膜破裂；细胞核降解严重，细胞出现质壁分离现象(图1e、f)。

这一时期，非替码板栗大板红的Ca²⁺分布没有明显变化，仍然主要分布在细胞壁、细胞间隙和内质网上。而替码板栗X12 Ca²⁺的分布发生了比较明显的变化：细胞间隙中Ca²⁺变得极少，Ca²⁺沉淀颗粒分布比较分散；细胞壁上Ca²⁺颗粒也明显减少；质膜和胞间连丝处则积累大量Ca²⁺颗粒；细胞质中的Ca²⁺分布明显增多；破裂的液泡内和液泡周围Ca²⁺颗粒也明显增多，呈小颗粒状分散分布；细胞核膜附近也积累了大量的Ca²⁺，呈小颗粒状或针状分布，并且密度较大；细胞核内Ca²⁺沉淀颗粒也明显增多，并呈均匀分布(图1e、f)。

2.4   S4时期X12芽体Ca²⁺超微细胞化学定位

S4时期，非替码板栗大板红细胞骨架结构仍没有任何降解迹象(图2d)，而替码板栗X12细胞结构则进一步解体：细胞骨架降解无法维持完整的结构，细胞壁多处出现断裂，液泡完全降解，细胞核进一步解体，由膜包被形成明显凋亡团粒，此时细胞内细胞器降解破碎，碎片浓缩于细胞中形成个数大小不等的团粒(图1g、h)。

与S3时期相比，非替码板栗大板红的Ca²⁺分布依旧没有明显变化(图2d)，而替码板栗X12的Ca²⁺黑色沉淀颗粒在细胞内呈无规则分布，质膜和细胞壁上分布较少，几乎集中于破碎的液泡膜和液泡碎片处，个别Ca²⁺成团粒状积累(图1g、h)。

2.5   S5时期X12芽体Ca²⁺超微细胞化学定位

S5时期，非替码板栗大板红细胞骨架结构仍保持正常，几乎没有变化，Ca²⁺仍然主要分布在细胞壁、细胞间隙和内质网上，细胞质和细胞核中Ca²⁺依旧分布很少，液泡中仍检测不到Ca²⁺的存在(图2e)。而替码板栗X12此时细胞已经死亡，细胞骨架降解或变形严重，细胞壁萎缩，液泡、细胞核和其他细胞器已经不完整存在，均降解破碎，Ca²⁺随降解的细胞器碎片成块状聚集(图1i、j)。

3.   讨论

3.1   替码板栗X12芽体PCD过程中细胞内增加的Ca²⁺的来源

Ca²⁺作为第二信使实现信号传递的过程是通过精确控制细胞质Ca²⁺的时间、空间和浓度参数的变化来实现的，显然细胞内Ca²⁺的分布与转移是形成Ca²⁺信号的基础^[16]。在植物细胞中，细胞间隙和细胞壁是胞外Ca²⁺库，液泡、内质网和线粒体等细胞器是胞内Ca²⁺库，在植物细胞基质中游离Ca²⁺水平很低，Ca²⁺主要储存在胞外和胞内钙库中，当细胞受到外界生物或非生物刺激时，引起细胞内钙库Ca²⁺的释放或胞外Ca²⁺内流，造成细胞质基质内Ca²⁺水平的迅速升高，形成Ca²⁺信号，从而引起细胞体内的一系列级联反应，引发一系列生理生化过程，从而起到传递胞外信号的作用^{[5, 17]}。辣椒叶片导管分子细胞程序性死亡(PCD)过程中细胞质中增加的Ca²⁺来自于胞外钙库(细胞壁和细胞间隙)^[13]；毛竹茎秆纤维细胞PCD过程中细胞质中Ca²⁺浓度的增加主要来自于胞内钙库(液泡)^[14]。本研究中，Ca²⁺亚细胞定位发现：对照的非替码板栗大板红在S1~S5时期，细胞内Ca²⁺的时空变化不明显，Ca²⁺一直主要分布在细胞壁、细胞间隙和内质网上；而在替码板栗X12芽体PCD过程中细胞内Ca²⁺空间和浓度发生明显变化，S1时期Ca²⁺主要分布在细胞壁和细胞间隙处，S2时期细胞壁和细胞间隙中的Ca²⁺颗粒减少，细胞质、液泡和细胞核中的Ca²⁺颗粒明显增加，S3时期细胞质中的Ca²⁺颗粒达到了最高值，这说明替码板栗X12芽体PCD过程中激素等第一信使引起了细胞内Ca²⁺的重新分布和浓度发生变化，即形成了细胞钙信号，而这种钙信号来源可能主要来自胞外钙库(细胞壁和细胞间隙)。这与辣椒导管分子PCD的相关研究结果^[13]一致。另外，本研究发现非替码板栗大板红在S1~S3时期，Ca²⁺除了一直主要分布在细胞壁、细胞间隙上外，内质网上也一直分布较多，说明在非替码板栗大板红芽体中，内质网可能是胞内钙库，但是替码板栗X12在S1~S2时期内质网上的Ca²⁺时空变化不明显，所以还不能确定替码板栗X12芽体PCD过程中Ca²⁺信号形成的来源也包括胞内钙库(内质网)，有关这方面的结果还需要进一步研究验证。

3.2   替码板栗X12芽体PCD与Ca²⁺时空变化的关系

植物PCD过程受细胞内外多种信号系统的诱导和调控^{[2, 5]}，而Ca²⁺在整个PCD信号转导过程中起着接收和传递信号的作用，而且钙信使系统起作用的中心环节是细胞中Ca²⁺的空间和浓度的变化^{[8, 15, 18]}。前人研究表明：细胞质内增加的Ca²⁺激活了一系列用于细胞质和细胞核降解的钙依赖性水解酶活性，从而引发了细胞的PCD。另外还可以激活核膜上ATP依赖的Ca²⁺摄取系统，升高细胞核的Ca²⁺浓度，并导致核酸内切酶的活化和DNA的断裂^[19-20]。GROOVER等^[21]研究认为：Ca²⁺的胞质内流导致液泡膜解体和细胞质流动停止，进而启动了细胞死亡，然后解体的液泡和细胞质混合而引起了细胞的原位自溶。本试验中，替码板栗X12芽体细胞内Ca²⁺空间和浓度发生的动态变化与芽体细胞PCD发生相对应。S1时期，Ca²⁺主要分布在细胞壁和细胞间隙处，此时细胞骨架结构正常，细胞器完整；S2时期，细胞间隙中Ca²⁺减少，细胞质、液泡膜和细胞核膜附近Ca²⁺开始增多，此时部分液泡轻微破裂；S3时期，细胞间隙和细胞壁上Ca²⁺颗粒极少，细胞质、细胞核、破裂的液泡内及液泡周围Ca²⁺明显增多，而此时细胞进一步解体，细胞壁、液泡、细胞核降解严重，而且DNA降解严重^[22]；S4时期，细胞解体严重，Ca²⁺在质膜和细胞壁上分布较少，主要集中于破碎的液泡膜和液泡碎片处，此时芽体DNA降解片段形成了模糊的弥散带^[22]；S5时期，细胞死亡，细胞骨架降解或变形严重，细胞壁萎缩，液泡、细胞核和其他细胞器已经不完整存在，均降解破碎，Ca²⁺随降解的细胞器碎片聚集在团粒处，此时电泳已经检测不到芽体DNA的存在^[22]。而对照品种大板红在S1~S5时期，Ca²⁺一直主要分布在细胞壁、细胞间隙和内质网上，细胞骨架结构一直保持正常，而且芽体DNA一直未发生降解现象^[22]。以上结果说明：Ca²⁺从细胞壁和细胞间隙向细胞质内、液泡和细胞核附近及内部转移引起替码板栗芽体PCD，Ca²⁺的时空变化与芽体PCD有密切关系。笔者推测，细胞质、液泡和细胞核内Ca²⁺的增加可能首先直接或间接导致了液泡的破裂，之后引起DNA降解及细胞骨架的解体。但Ca²⁺内流到细胞后到底是激活了何种促使液泡膜破裂的蛋白酶导致液泡破裂以及液泡内释放了何种PCD执行阶段的相关酶降解细胞仍未可知，有关这方面的问题有待进一步细化研究。