中药材艳山姜，为姜科山姜属植物艳山姜[Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt. et Smith]的干燥成熟果实。姜科全世界约50属1 300余种，广泛分布于热带亚热带。艳山姜凭借其独特的形态，在观赏植物界占据了一席之地^[1]。

艳山姜具有温中燥湿、行气止痛、截疟、祛风、健胃、化瘀的功效，作为贵州民族药被广泛用于治疗心腹冷痛、胸腹胀满、消化不良、呕吐腹泻等症状^[2]；主要活性成分为其挥发油。国内对艳山姜研究较少。前期研究主要集中于艳山姜栽培、组培、生药学特征、组织化学成分等方面^[3-7]；近年来的研究主要集中于对艳山姜活性成分挥发油的组分及药理学作用^[8-10]，显示艳山姜挥发油具有良好的保护脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤功能，可预防和治疗动脉粥样硬化等心血管疾病。据张彦燕等^[11]统计：已确定艳山姜的化学成分101种，主要活性成分为挥发油类、黄酮类、二萜类和有机酸类等化合物。陶玲等^[12]研究表明：艳山姜挥发油具有较好的抗炎镇痛作用；还可增加血管内皮舒张因子NO的分泌与释放，对脂多糖诱导损伤的血管内皮具有保护作用^[13]。国外近期研究主要集中于日本对艳山姜叶或果实中活性成分的活性及药理作用进行研究，表明艳山姜的活性成分具有良好的抗氧化作用，对皮肤病有一定的治疗作用^[14]，对HIV-1整合酶和神经氨酸酶具有抑制作用^[15]，具有抗动脉粥样硬化作用^[16]，对高血压具有一定治疗作用^[17]；具有抗衰老作用^[18]。此外，艳山姜的活性成分具抗氧化作用，可清除DPPH，ABTS和PMS-NADH，同时可以抑制皮肤病相关酶(胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、酪氨酸酶)的活性^[19]。艳山姜叶子的提取物可通过抑制氧化作用延长线虫寿命^[20]。国内外对于艳山姜病害的研究却十分少见，对病害的防治未见报道。

艳山姜作为贵州少数民族地区精准扶贫重点发展的种植项目，集药用、香料、纤维、观赏植物和喀斯特地区石漠化治理所筛选的植物于一身，在当地农民的经济收入中占有重要的地位。近年来，贵州省贞丰县种植的艳山姜逐渐开始出现病害并有加重趋势，其中真菌病害可导致艳山姜果实产量下降，品质降低，严重影响了农民收入。2015—2016年，笔者在贵州省兴义市贞丰县连环乡对艳山姜病害进行调查研究时发现一种艳山姜叶部病害，该病害主要危害艳山姜的茎、叶和果实。感染病叶呈现圆形或椭圆形褐色，中间为灰白色或暗白色，有些甚至出现穿孔，病健交界极为明显，后期病斑出现黑色小颗粒，染病艳山姜果实由青转黄并逐渐枯萎掉落，严重影响艳山姜产量，给药农造成了巨大的经济损失。本研究对该病害病原菌进行了鉴定，同时对其化学防治进行了初探，为该病害的防治提供了理论支持。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

艳山姜病叶：于2016年3月采自贵州省贞丰县连环乡；供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基：39 g PDA粉末(上海博微生物科技有限公司生产)配制成1 L，121 ℃灭菌30 min备用；供试杀菌剂：购自市场(表1)。

表  1  供试杀菌剂信息

Table  1.  Information of test fungicides

药剂名称name of pharmacy	剂型dosage form	生产厂家manufacturer
80%多菌灵 80% carbendazim	可湿性粉剂WP	英国邦农得农用化学集团公司
75%百菌清 75% chlorothalonil	可湿性粉剂WP	青岛奥迪斯微生物科技有限公司
70%甲基托布 70% thiophanate methyl	可湿性粉剂WP	山西德威生化科技有限责任公司
80%代森锰锌 80% mancozeb	可湿性粉剂WP	山西德威生化科技有限责任公司
57.6%冠菌清57.6% Cu(OH)2	水分散粒剂WDG	澳大利亚新农有限公司
250 g/L嘧菌酯250 g/L azoxystrobin	悬浮剂SC	上虞颖泰精细化工有限公司
25%咪鲜胺25% prochloraz	乳油EC	江苏辉丰农化股份有限公司
注：WP. 可湿性粉剂；WDG. 水分散粒剂；SC. 悬浮剂；EC. 乳油。 Note: WP. wettable powder; WDG. water dispersible granules; SC. suspension concentrate; EC. emulsifiable concentrate.

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1.2   病原菌分离培养与纯化

按常规组织分离法进行病原菌分离，分离病原菌前准备好已经加入适量青霉素的PDA平板。选取有典型症状的病叶，用自来水冲洗干净，滤纸擦拭干，将病健交界处组织剪成小块(3~5 mm)。在无菌条件下，将小块叶片先放入70%乙醇浸泡10 s，再转移至0.1%升汞浸泡2~3 min进行消毒处理，经无菌水漂洗3次后，用滤纸吸干，将叶片组织移入PDA平板上，PDA平板置于25 ℃培养箱培养，定期观察记录，并及时对叶片组织长出的菌落进行分离纯化。

1.3   致病性测定

按柯赫氏法则，采用针刺法进行鉴定。将分离纯化后得到的菌落转接到含PDA培养基的培养皿内进行扩大培养。挑选健康的艳山姜叶片进行回接试验。截取健康的叶片(约 6 cm×6 cm)，清洗干净，晾干，用无菌处理的针刺叶片，并将分离得到的菌块置于针刺处，菌丝面贴在叶片针刺处，放在无菌处理的吸水纸上，放入培养皿中，加入无菌水保湿，25 ℃下培养6~7 d，每片叶片组织接种4个位置，同时使用无菌PDA菌块作为对照培养，观察发病情况。之后将接种叶片组织病状与田间采集的典型病斑和对照组进行对比，出现典型症状后，取染病部位进行再分离，并与原接种菌比较。

1.4   病原菌鉴定

将菌株接种于PDA平板，于25 ℃恒温条件下培养，观察菌落颜色、形状及菌丝的疏密程度等；产孢后在显微镜下观察其分生孢子的形态，并测量分生孢子大小。对病原菌使用试剂盒法进行菌丝DNA提取，PCR扩增ITS序列，送样到北京诺赛生物有限公司进行测序和NCBI Blast序列比对。结合形态学及分子系统学数据对病原菌进行鉴定。

1.5   室内药效试验

杀菌剂对菌丝的抑制效果测定，采用含药平板法^[21]。将上述7种药剂分别配制成含有有效成分质量浓度为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/mL的6种溶液。在无菌操作台中，用灭菌过的移液枪枪头和10 mL量筒，在培养皿中加入1 mL配好的杀菌剂溶液，外加已灭菌并适当降温的PDA培养基9 mL，混匀，配成10 mL的含药培养基，以加入1 mL无菌水和9 mL灭菌PDA培养基的平板作为空白对照。待培养基冷凝后，在培养皿中央接种直径0.5 cm的病原菌菌块，每个培养皿放1块菌块，每种药剂的各质量浓度设立3个重复试验。将接种好的培养皿放在25 ℃恒温培养箱中培养5 d后，采用十字交叉法测量菌落直径，并按照公式：抑制率=(对照菌落直径−处理菌落直径)/对照菌落直径×100%，计算抑制率。将对菌丝的抑制率换算成机率值，以各处理的杀菌剂的质量浓度对数值为自变量(X)，以相应处理对病原菌菌丝机率值为应变量(Y)，用PBT软件处理数据，求出相应的回归曲线方程，及在抑制率为50%时的浓度(EC₅₀)。

2.   结果与分析

2.1   症状描述及病原菌特征

该真菌病害主要危害艳山姜的茎、叶和果实(图1)。染病叶片呈现圆形或椭圆形褐色，中间为灰白色，有些甚至穿孔，病健交界极为明显，后期病斑出现黑色小颗粒，染病艳山姜果实由青转黄并逐渐枯萎脱落。病原菌菌落毡状，白色，边缘规整，后期正面有黑色点状分生孢子团，反面从中心向外缘零星变黑。分生孢子由5个细胞组成，成纺锤状、直或稍微弯曲，大小为(21.5~26.5) μm×(6.0~7.5) μm，5个细胞由3个有色细胞和2个无色细胞组成，4个隔膜均为真隔膜，中间为3个褐色细胞，13.0~16.0 μm，两端为2个无色细胞，顶部无色细胞为三角锥形，着生1根无色附着丝，底部无色细胞为三角锥形，着生3~4根无色附着丝。结合ITS序列NCBI比对结果，初步将该病原菌鉴定为1株新拟盘多毛孢属种(Neopestalotiopsis sp.)。初步将该病害命名为艳山姜褐斑病。

图  1  艳山姜褐斑病病斑及其病原真菌

注：a. 病株田间病状；b. 回接试验叶片组织反面；c. 回接试验叶片组织正面；d~g. 病原菌分生孢子显微形态；h. 病原菌PDA培养菌落正面；i. 病原菌PDA培养菌落反面。

Figure  1.  Alpinia zerumbet cercospora leaf spot and its pathogen

Note: a. field symptoms of disease; b. the reverse side of re-inoculation leaves; c. positive side of re-inoculation leaves; d-g. conidial morphology; h. positive side of pathogen PDA colonies; i. the reverse side of pathogen PDA colonies.

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2.2   药效试验结果

7种不同的供试药剂对病原菌菌丝生长的抑制作用存在明显差异(表2)。80%多菌灵对病原菌的生长无明显抑制效果，其他6种化学药剂对病原菌生长均存在一定的抑制作用，且随着浓度的增大，对病原菌的抑制作用增强，菌落生长直径越小。在最高质量浓度4.000 μg/mL下，抑制率达到65%以上的药剂有70%甲基托布津可湿性粉剂和25%咪鲜胺乳油。250 g/L嘧菌酯对病原菌的抑制有一定效果，但在本试验中抑菌效果不佳。75%百菌清、80%代森锰锌和57.6%冠菌清对病原菌的抑制效果则不明显。

表  2  不同质量浓度杀菌剂的抑菌结果

Table  2.  Inhibition effect of different mass concentrations of fungicides

药剂 pharmacy	ρ/(μg·mL−1)	菌落直径/ cm colony diameter	抑制率/% inhibition rate			药剂 pharmacy	ρ/(μg·mL−1)	菌落直径/ cm colony diameter	抑制率/% inhibition rate
80%多菌灵 80% carbendazim	0.125	5.73	0.00			57.6%冠菌清 57.6% Cu(OH)2	0.125	5.66	0.00
	0.250	5.72	0.00				0.250	5.62	0.00
	0.500	5.70	0.00				0.500	5.55	1.26
	1.000	5.62	0.00				1.000	5.43	2.51
	2.000	5.60	0.00				2.000	5.40	3.05
	4.000	5.60	0.00				4.000	5.37	3.59
75%百菌清 75% chlorothalonil	0.125	5.67	0.00			250 g/L嘧菌酯 250 g/L azoxystrobin	0.125	4.38	21.36
	0.250	5.40	3.05				0.250	4.22	24.24
	0.500	5.25	5.78				0.500	4.12	26.03
	1.000	4.90	12.03				1.000	3.97	28.73
	2.000	4.83	13.29				2.000	3.76	32.50
	4.000	4.80	13.82				4.000	3.67	34.11
70%甲基托布津 70% thiophanate methyl	0.125	5.20	6.53			25%咪鲜胺 25% prochloraz	0.125	2.93	47.32
	0.250	3.97	28.71				0.250	2.13	61.62
	0.500	3.67	32.41				0.500	2.07	62.77
	1.000	2.43	56.20				1.000	1.32	76.37
	2.000	1.48	73.28				2.000	0.93	83.22
	4.000	1.18	78.73				4.000	0.48	91.01
80%代森锰锌 80% mancozeb	0.125	5.42	2.69			CK(对照)	—	5.57	0.00
	0.250	5.40	3.05
	0.500	5.40	3.05
	1.000	5.38	3.41
	2.000	5.37	3.59
	4.000	5.37	3.95

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将70%甲基托布津和25%咪鲜胺组培养皿测得的菌落直径，根据公式测得抑制率。25%咪鲜胺的EC₅₀为0.150 3 μg/mL，70%甲基托布津的EC₅₀为0.872 3 μg/mL。在本次药剂筛选试验中，25%咪鲜胺EC₅₀值最低，其次是70%甲基托布津，故25%咪鲜胺的抑菌效果最好。

3.   讨论

近几年，笔者发现贵州艳山姜主要种植地区艳山姜产量及品质存在明显的下降趋势，其中一个重要原因就是真菌病害。国内对艳山姜真菌病害的研究未见报道。对于同属的部分种的病害有少量报道。1986年刘永正^[22]报道了一种山姜属植物大草寇的炭疽病，严重危害大草寇的产量与品质。本研究发现了1种艳山姜的新病害，将其定名为艳山姜褐斑病，该病害为国内外首次报道。通过柯赫氏法则分离并鉴定艳山姜褐斑病病原菌为新拟盘多毛孢属真菌(Neopestalotiopsis sp.)，该病原菌为国内外首次在艳山姜病害中发现，具有重要的学术研究意义。因为该病原菌疑似新种，暂未命名到种，后续研究中我们将会对其鉴定到种，并进行命名。艳山姜褐斑病主要危害艳山姜的茎、叶和果实，叶片染病后呈现圆形或椭圆形褐色，中间为灰白色，有些甚至穿孔，病健交界极为明显，后期病斑出现黑色小颗粒，染病艳山姜果实由青转黄并逐渐枯萎脱落，严重影响艳山姜产量及品质。据笔者后期产量测定结果显示：贵州贞丰县连环乡艳山姜种植区，艳山姜褐斑病发病最为严重，艳山姜产量减产41%~53%。同时艳山姜品质严重下降，致使艳山姜果实价格较往年低，对种植户的经济收入造成了重大损失。本研究对该病害的病原菌进行了室内药效试验，初步结果显示：25%咪鲜胺的抑菌效果最好，在后续田间试验中可考虑使用25%咪鲜胺乳油对该病害进行防治。

艳山姜褐斑病在贵州省多数艳山姜种植地区发病严重，严重影响了艳山姜果实的产量及品质，产量降低可高达35%以上，每亩损失可高达800元。本研究对该病害的病原菌进行了鉴定，明确了病原真菌，同时对该病害的病原真菌进行了室内药物对峙试验，后续我们将继续进行室内试验，筛选更加有效的化学杀菌剂，同时结合田间试验对化学杀菌剂防治艳山姜褐斑病的效果进行验证，为农户化学防治艳山姜褐斑病提供了可选的杀菌剂，将为艳山姜褐斑病的防控提供技术支持。