3种沉水植物根际对沉积物中典型氮循环微生物功能基因丰度的影响
Effects of the Rhizospheres of Three Submerged Plants on the Abundances of Functional Genes of Typical Nitrogen Cycle Microorganisms in Sediments
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Keywords:
- submerged plant /
- sediment /
- inorganic nitrogen /
- nitrogen cycle bacteria
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近年来，湖泊富营养化已成为全球共同的重大环境问题[1]，它伴随着水生植物的急剧消亡，水体生态功能的迅速退化。目前普遍认为氮和磷在湖泊富营养化的过程中起关键作用，而在某些湖泊生态系统初级生产力中，氮甚至比磷起到了更为重要的作用[2-3]，无机态氮是沉积物中迁移转化的主要形态，因此减少其含量对于水环境质量的改善具有重要的意义[4]。
沉水植物通过吸附水体中的生物性和非生物性的悬浮物质改善水质，提高水体透明度，增加水体溶氧，因此恢复沉水植物是湖泊富营养化修复的主要措施之一[5]。不同的沉水植物对藻类的生长也有一定的抑制作用，如：狐尾藻(Myriophyllum verticillatum)能有效抑制水华鱼腥藻和铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的生长[6]；苦草(Vallisneria natans)能抑制羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的生长[7]；但伊乐藻(Elodea nuttallii)几乎没有克藻作用[8]。另外沉水植物通过吸收水体中的氮、磷，可减少水体中的营养盐含量[9]，并在生长过程中通气组织将茎叶产生的氧气转移到根部，向根部周围泌氧，给好氧微生物提供了良好生存环境[10]，在微生物的作用下增强了硝化—反硝化作用和有机质的降解作用，从而改善沉积物的环境，主导着湖泊中的物质循环和营养传递过程。
氮循环菌的丰度和群落结构的变化能反应湖泊生态环境的情况，作为评判生态修复的重要指标[11]。好氧氨氧化细菌(aerobic ammonia-oxidizing bacteria, AOB)能够在有氧条件下将氨氧化为亚硝酸盐的化能无机自养型细菌。氨单加氧酶是氨氧化微生物所特有的一种胞内酶，其中amoA基因含有该酶的活性位点，可催化铵氧化为羟胺[12]，为微生物提供能量。因此通过对amoA基因的定量分析，可反映出环境中AOB的种类、数量和活性。但在典型的微生物群落中，AOB所占比例不足0.1%[13]，氨氧化古菌(ammonia oxidizing archaea，AOA)在数量、多样性及栖居范围方面都胜于AOB。nirK和nirS是编码NO合成过程的催化酶的基因片段，广泛存在于土壤、湿地和沉积物等各类环境中[14]，nirK和nirS虽然是编码同一个酶的基因片段，但它们的基因结构、作用方式和生态位具有较大的差异，所以nirK和nirS可以被用来表征分别具有这两种不同基因片段的反硝化菌[15]。另外，nosZ基因是编码N2O还原酶的基因片段，对于揭示沉积物中氮素转移与转化规律具有重要的意义[16]；肼氧化酶(HZO)由肼氧化酶基因所编码(hzO)，是厌氧氨氧化细菌(anaerobic ammonium oxidation, Anammox)的关键酶，能够在缺氧或厌氧条件下通过氧化NH4+、还原NO2生成氮气，降低水体中的铵态氮含量[17]。
本研究通过沉水植物模拟培养试验和原位悬挂试验，采用实时荧光定量PCR (qPCR)的方法，以氨单加氧酶基因(amoA)标记氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)；以nirK、nirS和nosZ基因标记反硝化细菌；以hzO基因标记厌氧氨氧化细菌(Anammox)来探究3种不同的沉水植物，水蕴草(Egeria densa)、狐尾藻(M. verticillatum)和苦草(V. natans)对沉积物中无机态氮含量以及几种氮循环菌丰度的影响，以期为湖泊富营养化的治理提供基础理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验用沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)取自滇池草海西岸湖滨带，驯化1周，取顶枝20 cm备用(苦草取整株，高度为20 cm)；沉积物取自滇池草海东南湖滨带(102 38'55.27″E；24 58'19.84″N)，过筛、混匀后备用；试验用水取自滇池草海湖滨带，过浮游动物网筛后备用。试验开始时间为2016年8月12日，秋季。
1.2 模拟培养试验
将沉积物混匀后分装到140个1 L的塑料碗中，然后7个1组置于12个120 L的大桶中，上覆试验用水。静置1 d后试验组分别种植水蕴草、狐尾藻、苦草，每组设3个平行，对照组未种植沉水植物。待准备完成后将大桶置于示范工程地走道，露天培养，盖上玻璃盖，并使玻璃盖略微翘起，保持桶内空气流通，每隔30 d加水1次。分别于第0、10、20、32、48和210天取样，取样方法为试验组和对照组各随机取出1个塑料碗用于后续测定。
取样时采用破坏性取样的方法，并将黏附在植物根上的沉积物定义为根际沉积物。将试验组沉水植物连根拔起，采集黏附在根部周围所有沉积物样品；对照组去除表层1 cm的沉积物，混匀后采集沉积物样品。一部分沉积物直接置于密封袋中，4 ℃暂存当天进行沉积物理化指标分析。另一部分沉积物经真空冷冻干燥后，置于密封袋中，−20 ℃保存用于DNA的提取。
1.3 原位悬挂试验
将沉积物分装到20个5 L塑料桶中，桶内种植苦草，对照组不种植任何植物，悬挂于滇池草海，300 d后进行破坏性取样，取样方法同模拟培养试验。
1.4 沉积物中的理化指标分析
沉积物中的铵态氮采用靛酚蓝分光光度法测定，硝态氮采用酚二磺酸比色法测定，亚硝态氮采用乙二胺萘乙酸分光光度法测定，具体方法详见《土壤调查试验室分析方法(2012)》[18]。硝化速率根据铵态氮培养液培养-硝酸盐氮检测法测定，反硝化速率根据硝酸盐氮培养液厌氧培养-硝酸盐氮检测法测定[19-20]。
1.5 DNA的提取和实时荧光定量PCR
称取0.25 g冻干的沉积物样品按照E.Z.N.A. ® Soil DNA Kit试剂盒(Omega Bio-tek, 美国)的说明书进行沉积物DNA的提取。
qPCR扩增反应体系为DNA模版1 μL，正反向引物(20 μmol/L)各1 μL (武汉爱康健生物技术公司合成)，2×iTaq Universal SYBR Green Supermix 10 μL (Bio-Rad Laboratories, 美国)，加无菌双蒸水至20 μL。实时荧光定量PCR反应在Bio-Rad CFX96 system (Bio-Rad Laboratories, 美国)中进行。扩增引物和反应条件见表1。阴性对照以无菌双蒸水代替DNA模板，每个样品及阴性对照均设3个重复。根据溶解曲线判断引物的特异性，扩增产物用1%的琼脂凝胶电泳检测。用已知含量的已插入目标基因的质粒为标准品，最高含量为107，10倍梯度稀释后用做标准曲线，采用的标准曲线效率在90%以上，相关性(R2)在0.95以上，定量沉积物中amoA、nirS、nirK、nosZ和hzO基因的拷贝数。
表 1 氮循环微生物功能基因PCR扩增引物和条件Table 1. Primers and procedures of nitrogen cycle microbial functional genes for PCR amplification基因
gene引物序列(5′→3′)
primers sequences程序
PCR proceduresAOA AmoAF：STAATGGTCTGGCTTAGACG 95 ℃，3 min；(95 ℃，45 s；53 ℃，1 min；72 ℃，1 min)×40[21] amoAR：GCGGCCATCCATCTGTATGT AOB amoA1F：GGGGTTTCTACTGGTGGT 95 ℃，3 min；(95 ℃，45 s；53 ℃，1 min；72 ℃，1 min)×40[21] amoA2R：CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC nirS nirSCd3aF：AACGYSAAGGARACSGG 94 ℃，2 min；(94 ℃，15 s；57 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×40[14] nirSR3cd：GASTTCGGRTGSGTCTTSAYGAA nirK nirK876：ATYGGCGGVCAYGGCGA 95 ℃，5 min；(95 ℃，15 s；66.4 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×40[14] nirK1040：GCCTCGATCAGRTTRTGGTT nosZ nosZ2F：CGCRACGGCAASAAGGTSMSSGT 95 ℃，5 min；(95 ℃，15 s；66.4 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×40[14] nosZ2R：CAKTRGCAKSGCRTGGCAGAA hzO HzO1F：AAGACNTGYCAYTGGGGWAAA 95 ℃，5 min；(95 ℃，45 s；50 ℃，1 min；72 ℃，1 min)×40[22] HzO1R：GACATACCCATACTKGTRTANACNGT 1.6 数据分析与处理
试验数据均采用SPSS 22.0软件进行统计与分析，以平均值±标准差(mean±SD)表示。检测数据正态分布和方差齐性后，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，然后用Tukey检验比较各样本数据之间的差异显著性，P<0.05认为在统计学具有显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 沉水植物对根际沉积物无机态氮含量的影响
在模拟培养试验条件下，种植沉水植物的试验组和未种植的对照组中，根际沉积物铵态氮含量在试验周期内显著下降(P<0.05)，试验组铵态氮含量的下降速率在20 d内显著高于对照组，而后逐渐趋于稳定(图1A)；悬挂于滇池中培养300 d的苦草，其根际沉积物铵态氮含量接近为0 μg/g，显著低于对照组(图1a)。
在沉水植物培养20 d内，其根际沉积物硝态氮含量略微下降，并在试验末期上升至4 μg/g干重，试验组与对照组的变化规律一致(图1B)。其根际沉积物亚硝态氮含量极低，持续波动，狐尾藻组在试验末期升至0.2 μg/g干重(图1C)；悬挂于滇池中培养300 d的苦草，其根际沉积物硝态氮和亚硝态氮含量与对照组之间差异不显著(图1b、c)。
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图 1 不同沉水植物根际沉积物中无机态氮(铵态氮、硝态氮和亚硝态氮)的含量注：A)、B)、C)分别表示不同沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)模拟培养试验根际沉积物中铵态氮、硝态氮和亚硝态氮的含量；a)、b)、c)分别表示苦草原位悬挂试验根际沉积物中铵态氮、硝态氮和亚硝态氮的含量。数据表示为“平均值±标准差”，不同字母或星号(*)表示具有显著性差异(P<0.05)。VN. 苦草根际；CK. 对照；下同。Figure 1. The content of inorganic nitrogen (ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen) in sediments of three different submerged plantsNote：A), B) and C) represented that the content of ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in sediments of three different submerged plants (E. densa, M. verticillatum and V. natans) in simulation experiment, respectively; a), b) and c) represented that the content of ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in sediments of V. natans in field investigation, respectively. Data are expressed as mean±SD (n=3). Data with different letters or asterisk (*) indicates that they are significantly different (P<0.05). VN. V. natans; CK. control; the same as below.2.2 沉水植物对根际沉积物硝化和反硝化速率的影响
对照组和试验组中，根际沉积物的硝化速率在210 d中呈总体下降的趋势，各试验组中，其硝化速率均在试验初期上升，第10天达到峰值后开始逐渐下降(图2A)。第10天时，狐尾藻组硝化速率最大为2.3 μg/(h∙g)干重，与对照组具有显著性差异(P<0.05)；苦草组与水蕴草组之间差异不显著(P>0.05)。悬挂试验中，苦草根际沉积物硝化速率与对照组之间差异不显著(图2a)。
对照组和试验组中，根际沉积物的反硝化速率随时间的变化规律基本一致(图2B)。试验初期变化趋势较为稳定，但在试验末期，反硝化速率增长较快，与硝态氮的变化趋势一致。第210天，狐尾藻根际沉积物的反硝化速率显著高于水蕴草组和苦草组(P<0.05)。悬挂试验中，苦草根际沉积物反硝化速率显著低于对照组(P<0.05，图2b)。
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图 2 不同沉水植物根际沉积物中的硝化速率和反硝化速率注：A)和B)分别表示不同沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)模拟培养实验根际沉积物中的硝化速率和反硝化速率；a)和b)分别表示苦草原位悬挂实验根际沉积物中硝化速率和反硝化速率。Figure 2. The nitrification and denitrification rate in sediments of three different submerged plantsNote：A) and B) represented that the sediments nitrification and denitrification rate of three different submerged plants (E. densa, M. verticillatum and V. natans) in simulation experiment, respectively; a) and b) represented that the sediments nitrification and denitrification rate of V. natans in field investigation.2.3 沉水植物对根际沉积物氨氧化菌amoA基因的定量
水蕴草根际沉积物AOA amoA的基因拷贝数在第48天显著低于对照组(P<0.05)，同时狐尾藻和苦草根际沉积物AOAamoA的基因拷贝数在第48天均与对照组之间差异不显著(P>0.05)，但在第210天显著高于对照组(P<0.05，图3A)；悬挂于滇池300 d后，苦草根际沉积物AOA amoA的基因拷贝数比对照组高出3个数量级(P<0.05，图3a)。
水蕴草根际沉积物AOB amoA的基因拷贝数在第48天时显著高于其他各组(P<0.05)，但在试验末期下降至和对照组同一水平(P>0.05)；狐尾藻和苦草根际沉积物AOBamoA的基因拷贝数在试验末期显著高于对照组(P<0.05，图3B)，但AOB amoA/AOA amoA比值显著低于对照组(P<0.05，图3C)。悬挂于滇池300 d后，苦草根际沉积物AOB amoA的基因拷贝数高于对照组(图3b)，AOB amoA/AOA amoA比值显著低于对照组(P<0.05，图3c)。
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图 3 不同沉水植物根际沉积物中amoA基因的拷贝数注：A)和B)分别表示不同沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)模拟培养试验根际沉积物中AOA和AOB amoA基因的拷贝数；a)和b)分别表示苦草原位悬挂试验根际沉积物中AOA和AOB amoA基因的拷贝数；C)和c)表示AOB与AOA amoA基因拷贝数的比值。Figure 3. The copies of amoA genes in sediments of three different submerged plantsNote：A) and B) represented that the copies of AOA and AOB amoA genes in sediments of three different submerged plants (E. densa, M. verticillatum and V. natans) in simulation experiment, respectively; a) and b) represented that the copies of AOA and AOB amoA genes in sediments of V. natans in field investigation, respectively. C) and c) represented that the ratio of AOB and AOA amoA gene copies.2.4 沉水植物对根际沉积物反硝化菌nirS、nirK、nosZ基因的定量
苦草根际沉积物nirS，nirK和nosZ的基因拷贝数在试验第48天和第210天时显著高于对照组(P<0.05)，狐尾藻和苦草在试验末期(210 d)能显著增加其根际沉积物nirS、nirK和nosZ的基因拷贝数(图4A~C)，这与苦草原位悬挂试验的结果一致(图4a~c)。
狐尾藻根际沉积物nirS/nirK基因的比值在48 d时显著高于对照组，在试验末期低于对照组；而水蕴草根际沉积物nirS/nirK基因的比值则相反；苦草根际沉积物nirS/nirK基因的比值在试验第48天和210天时，均显著低于对照组(P<0.05，图4D)，这与苦草原位悬挂试验的结果一致(图4d)。
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图 4 不同沉水植物根际沉积物中反硝化功能基因(nirS、nirK和nosZ)的拷贝数注：A)、B)和C)分别表示不同沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)模拟培养试验根际沉积物中nirS、nirK和nosZ基因的拷贝数；a)、b)和c)分别表示苦草原位悬挂试验根际沉积物中nirS、nirK和nosZ基因的拷贝数；D)和d)表示nirS和nirK基因拷贝数的比值。Figure 4. The copies of denitrification functional genes (nirS, nirKand nosZ) in sediments of three different submerged plantsNote：A), B) and C) represented that the copies of nirS, nirK and nosZ genes in sediments of three different submerged plants (E. densa, M. verticillatum and V. natans) in simulation experiment, respectively; a), b) and c) represented that the copies of nirS, nirK and nosZ genes in sediments of V. natans in field investigation, respectively; D) and d) represented that the ratio of the copies of nirS and nirK.2.5 沉水植物对根际沉积物厌氧氨氧化菌hzO基因的定量
水蕴草能显著增加其根际沉积物的hzO基因的拷贝数，并且拷贝数在试验末期显著高于对照组(P<0.05)；而狐尾藻和苦草根际沉积物hzO基因拷贝数在试验末期与对照组之间差异不显著(P>0.05图5A)。悬挂试验中，苦草根际沉积物的hzO基因拷贝数高于对照组，这与模拟培养试验的结果不一致(图5a)。
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图 5 不同沉水植物根际沉积物中hzO基因的拷贝数注：A)表示不同沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)模拟培养试验根际沉积物中hzO基因的拷贝数；a)表示苦草原位悬挂试验根际沉积物中hzO基因的拷贝数。Figure 5. The copies of hzO genes in sediments of three different submerged plantsNote：A) represented that the copies of hzO genes in sediments of three different submerged plants (E. densa, M. verticillatum and V. natans) in simulation experiment, respectively; a) represented that the copies of hzO genes in sediments of V. natans in field investigation, respectively.3. 讨论
种植沉水植物能显著降低根际沉积物的铵态氮含量[23]，如金鱼藻(Ceratophyllum demersum)、苦草(V. natans)和眼子菜(Potamogeton distinctus)等[24-25]。这与本次试验结果一致，种植沉水植物的试验组铵态氮含量均显著降低。植物根系可以吸收沉积物中的铵态氮，与氨氧化菌的硝化和反硝化过程有关[26]，因此推测可能是由于沉积物中氮循环菌的硝化—反硝化和厌氧氨氧化等作用使铵态氮含量降低。研究发现种植黑藻(Hydrilla verticillata)使沉积物硝酸态氮含量上升[15]；在稻田、牧地等土壤的研究中也得到了类似的结果[27]。而这与本次试验结果不一致，种植沉水植物对亚硝酸态氮和硝酸态氮含量并无显著性影响。推测这可能与沉积物自身的性质相关[25]，硝酸态氮更易在有机质含量低且干燥、氧含量高的环境中累积[27]；而滇池沉积物中富含有机质，试验中的沉水植物根系泌氧量并不足以改变沉积物中的氧化还原电位[28]，沉积物依旧处于还原态的电位，因此硝酸态氮和亚硝酸态氮无法累积。
本研究中水蕴草、狐尾藻和苦草组的硝化速率在试验初期达到峰值，而后逐渐下降，这与水半边莲(Lobelia dortmanna)的研究结果类似[29]，由于沉水植物的根系泌氧作用促进了根际沉积物的硝化过程[29]。但当铵态氮浓度长期处于较低水平时，氨氧化功能基因处于受抑制的状态，硝化速率持续下降。同时，3种沉水植物均促进了根际沉积物中的反硝化速率，这与香蒲(Typha orientalis)、芦苇(Phragmites australias)和伊乐藻(E. nuttallii)的研究结果一致[24, 29]。由于春季狐尾藻较其他两种水草生长旺盛、根系较为发达，因此其根际沉积物的反硝化速率高于苦草和水蕴草组。
苦草和狐尾藻显著提高了根际沉积物AOA和AOB amoA基因拷贝数，这与黑藻(H. verticillata)根际沉积物AOB丰度随时间变化而增加的趋势一致[15]，但金鱼藻(C. demersum)等沉水植物对AOB基因丰度却没有明显影响[24]。推测原因可能为：(1)滇池草海的有机质含量较高，有机质会消耗植物根系分泌到根际沉积物的溶解氧，当溶解氧含量处于2.5~5 μmol/L时，使环境更适合AOA的生长[30]；(2)沉水植物的吸收和微生物的脱氮作用[26]，使根际沉积物的铵态氮含量在初期下降至较低的水平，较低的铵态氮含量限制AOB的生长[31]。AOA和AOB的数量和比例因栖息环境的不同而不同[32]，AOB的生长环境需要较高的铵态氮浓度，适宜的pH (7~7.5)、温度(25~30 ℃)和较高的溶解氧，这也是大多数淡水湖泊中AOA丰度远高于AOB的原因，如东湖、梁子湖等[33]。
由于不同沉水植物根系分泌物不同，因此不同沉水植物根际环境存在差异，从而影响nirK和nirS这两种反硝化细菌的丰度[27]。水蕴草根际沉积物nosZ基因拷贝数较高，推测水蕴草在氨氧化为硝酸态氮的过程中，会有大量的N2O作为nosZ的原料释放出来[16]。在之前的研究中，黑藻促进了根际沉积物厌氧氨氧化过程[15]，而水蕴草和黑藻同属水鳖科沉水植物，根系特征相似[34]，因此推测水蕴草也可能促进了根际沉积物厌氧氨氧化等过程。
4. 结论
种植沉水植物能显著降低根际沉积物的铵态氮含量；狐尾藻和苦草能显著增加植物根际沉积物AOA的nirK、nirS和nosZ基因拷贝数，对AOA amoA具有选择性，AOA是沉积物中氨氧化过程的主要承担者；苦草对nirK型反硝化菌有较好的选择性；水蕴草能显著增加其根际沉积物中hzO的基因拷贝数。因此推测反硝化是狐尾藻和苦草根际沉积物的主要脱氮方式；厌氧氨氧化过程是水蕴草根际沉积物的主要脱氮方式。
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图 1 不同沉水植物根际沉积物中无机态氮(铵态氮、硝态氮和亚硝态氮)的含量
注：A)、B)、C)分别表示不同沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)模拟培养试验根际沉积物中铵态氮、硝态氮和亚硝态氮的含量；a)、b)、c)分别表示苦草原位悬挂试验根际沉积物中铵态氮、硝态氮和亚硝态氮的含量。数据表示为“平均值±标准差”，不同字母或星号(*)表示具有显著性差异(P<0.05)。VN. 苦草根际；CK. 对照；下同。
Figure 1. The content of inorganic nitrogen (ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen) in sediments of three different submerged plants
Note：A), B) and C) represented that the content of ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in sediments of three different submerged plants (E. densa, M. verticillatum and V. natans) in simulation experiment, respectively; a), b) and c) represented that the content of ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in sediments of V. natans in field investigation, respectively. Data are expressed as mean±SD (n=3). Data with different letters or asterisk (*) indicates that they are significantly different (P<0.05). VN. V. natans; CK. control; the same as below.
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图 2 不同沉水植物根际沉积物中的硝化速率和反硝化速率
注：A)和B)分别表示不同沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)模拟培养实验根际沉积物中的硝化速率和反硝化速率；a)和b)分别表示苦草原位悬挂实验根际沉积物中硝化速率和反硝化速率。
Figure 2. The nitrification and denitrification rate in sediments of three different submerged plants
Note：A) and B) represented that the sediments nitrification and denitrification rate of three different submerged plants (E. densa, M. verticillatum and V. natans) in simulation experiment, respectively; a) and b) represented that the sediments nitrification and denitrification rate of V. natans in field investigation.
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图 3 不同沉水植物根际沉积物中amoA基因的拷贝数
注：A)和B)分别表示不同沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)模拟培养试验根际沉积物中AOA和AOB amoA基因的拷贝数；a)和b)分别表示苦草原位悬挂试验根际沉积物中AOA和AOB amoA基因的拷贝数；C)和c)表示AOB与AOA amoA基因拷贝数的比值。
Figure 3. The copies of amoA genes in sediments of three different submerged plants
Note：A) and B) represented that the copies of AOA and AOB amoA genes in sediments of three different submerged plants (E. densa, M. verticillatum and V. natans) in simulation experiment, respectively; a) and b) represented that the copies of AOA and AOB amoA genes in sediments of V. natans in field investigation, respectively. C) and c) represented that the ratio of AOB and AOA amoA gene copies.
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图 4 不同沉水植物根际沉积物中反硝化功能基因(nirS、nirK和nosZ)的拷贝数
注：A)、B)和C)分别表示不同沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)模拟培养试验根际沉积物中nirS、nirK和nosZ基因的拷贝数；a)、b)和c)分别表示苦草原位悬挂试验根际沉积物中nirS、nirK和nosZ基因的拷贝数；D)和d)表示nirS和nirK基因拷贝数的比值。
Figure 4. The copies of denitrification functional genes (nirS, nirKand nosZ) in sediments of three different submerged plants
Note：A), B) and C) represented that the copies of nirS, nirK and nosZ genes in sediments of three different submerged plants (E. densa, M. verticillatum and V. natans) in simulation experiment, respectively; a), b) and c) represented that the copies of nirS, nirK and nosZ genes in sediments of V. natans in field investigation, respectively; D) and d) represented that the ratio of the copies of nirS and nirK.
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图 5 不同沉水植物根际沉积物中hzO基因的拷贝数
注：A)表示不同沉水植物(水蕴草、狐尾藻和苦草)模拟培养试验根际沉积物中hzO基因的拷贝数；a)表示苦草原位悬挂试验根际沉积物中hzO基因的拷贝数。
Figure 5. The copies of hzO genes in sediments of three different submerged plants
Note：A) represented that the copies of hzO genes in sediments of three different submerged plants (E. densa, M. verticillatum and V. natans) in simulation experiment, respectively; a) represented that the copies of hzO genes in sediments of V. natans in field investigation, respectively.
表 1 氮循环微生物功能基因PCR扩增引物和条件
Table 1 Primers and procedures of nitrogen cycle microbial functional genes for PCR amplification
基因
gene引物序列(5′→3′)
primers sequences程序
PCR proceduresAOA AmoAF：STAATGGTCTGGCTTAGACG 95 ℃，3 min；(95 ℃，45 s；53 ℃，1 min；72 ℃，1 min)×40[21] amoAR：GCGGCCATCCATCTGTATGT AOB amoA1F：GGGGTTTCTACTGGTGGT 95 ℃，3 min；(95 ℃，45 s；53 ℃，1 min；72 ℃，1 min)×40[21] amoA2R：CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC nirS nirSCd3aF：AACGYSAAGGARACSGG 94 ℃，2 min；(94 ℃，15 s；57 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×40[14] nirSR3cd：GASTTCGGRTGSGTCTTSAYGAA nirK nirK876：ATYGGCGGVCAYGGCGA 95 ℃，5 min；(95 ℃，15 s；66.4 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×40[14] nirK1040：GCCTCGATCAGRTTRTGGTT nosZ nosZ2F：CGCRACGGCAASAAGGTSMSSGT 95 ℃，5 min；(95 ℃，15 s；66.4 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×40[14] nosZ2R：CAKTRGCAKSGCRTGGCAGAA hzO HzO1F：AAGACNTGYCAYTGGGGWAAA 95 ℃，5 min；(95 ℃，45 s；50 ℃，1 min；72 ℃，1 min)×40[22] HzO1R：GACATACCCATACTKGTRTANACNGT 
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