PRRSV对IFN-γ及其关键信号分子mRNA转录的影响
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关键词:
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒 /
- 猪肺泡巨噬细胞 /
- γ干扰素 /
- 干扰素调节因子3 /
- 干扰素调节因子7
Effects of PRRSV on Transcription of IFN-γ and Its Key Signal Molecules
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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种猪病毒性传染病，患病的怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，其他年龄段的猪感染该病毒后出现严重的呼吸系统疾病[1-2]。由于 PRRSV具有易变异、抗体依赖性增强(antibody dependent enhancement，ADE)和免疫抑制等特点，全球养猪业以及猪肉的食品安全面临着严峻的挑战。PRRSV主要在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)中复制繁殖[3]，因此，PAMs在PRRSV的研究中具有关键作用。
干扰素(interferon，IFN)是一类抗病毒细胞因子，在病毒感染早期，干扰素由病毒诱导细胞产生，具有较强保护力。根据分子结构、免疫原性和受体特异性的不同可将IFN分为I型、II型和III型，其中干扰素调节因子3 (interferon regulation factors 3，IRF3)和干扰素调节因子7 (interferon regulation factors 7，IRF7)在干扰素产生的信号通路中发挥着关键作用。IFN-γ作为先天性和适应性免疫反应的重要介质，能够清除外来病原体及肿瘤。 IFN-γ具有抗病毒作用，同时还能介导巨噬细胞活化，增加其吞噬作用，促进促炎细胞因子产生、增加微生物活性氧以及氮物质的产生，进而清除细胞内的病原体[4]。有研究发现：PRRSV感染宿主细胞后仅能检测到低水平的IFN-γ[5]，而重组pIFN-γ不但能有效抑制PRRSV，同时还对免疫抑制猪具有良好免疫调节作用，增强疫苗的免疫效果[6]。因此，本试验就PRRSV云南株体外感染PAMs后对IFN-γ及其信号分子mRNA转录量的变化进行检测，旨在为PRRSV的免疫抑制机制和防控提供理论依据和技术支持。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒
TCID50为105.06 mL−1的PRRSV云南株YN-2011由本实验室分离纯化保存(登录号：JX857698)[7]。
1.1.2 细胞
PAMs从健康仔猪肺脏中分离得到[8]。
1.2 方法
1.2.1 试验分组
将分离的PAMs以2×106 mL−1的密度铺在6孔板于37 ℃、5% CO2培养。将培养的PAMs分为对照组和PRRSV组，PRRSV组加PRRSV病毒悬液100 μL，对照组加等量的1640培养液。分别在感染后的6、12、24、48、60 h收集 PAMs及其上清液，−80 ℃保存，每组设3个重复。
1.2.2 PAMs上清中IFN-γ的质量浓度检测
按照Swine IFN-γ ELISA Kit试剂盒说明书进行样品的处理和检测。
1.2.3 IFN-γ及其信号分子mRNA转录水平的检测
采用TRIzol提取各组细胞总RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA，并以其为模板，利用本实验室建立的 qPCR 进行检测。引物由上海生工合成(表1)。
表 1 荧光定量PCR引物序列Table 1. Real-tine PCR primer sequences基因gene 引物序列 primer sequence 退火温度/℃ T m 目的片段/bp fragment size β-actin F:5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′ 52 122 R:5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT -3′ PRRSV F:5′-GTCAGACATCACTTTACCCCTAG-3′ 60 123 R:5′-CTCCACAGTGTAACTTATCCTCC-3′ IFN-γ F:5′-GGCCATTCAAAGGAGCATGG-3′ 60 147 R:5′-AGTTCACTGATGGCTTTGCG-3′ IRF-3 F:5′-GGTGCCTACACTCCTGG-3′ 60 105 R:5′-GTGGTCCTCTGCTAAACG-3′ IRF-7 F:5′-CGCCTCCTGGAAAACCAA-3′ 60 76 R:5′-CCCTGAGTTGTCCTGCAACA-3′ 1.2.4 数据分析
所有数据用“mean±SD”表示，应用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析。
2. 结果与分析
2.1 感染后第24小时不同处理组PAMs形态
图1显示：正常组贴壁的PAMs呈圆形，细胞质丰富；PRRSV感染组的PAMs在24 h可见细胞变圆、聚集，并随着时间的延长最后出现脱落、悬浮、崩解、破碎和死亡。
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图 1 24 h各组细胞的观察(200×)Figure 1. PAMs in different treatment groups for 24 h under inverted microscope2.2 PAMs上清液IFN-γ的质量浓度
检测不同时间点PAMs上清液中IFN-γ的质量浓度(图2)可知：PRRSV组IFN-γ的质量浓度与对照组相比无显著性差异。PRRSV组IFN-γ的生成量在6~48 h逐渐升高，48 h达到最大值，6 h时IFN-γ的质量浓度低于对照组。
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图 2 不同时间点不同处理IFN-γ质量浓度(ρ)变化Figure 2. The change of IFN-γ mass concentrations at different time points2.3 PRRSV mRNA转录水平的动态变化
由图3可知：PRRSV组PRRSV的mRNA转录水平在感染后的6~24 h逐渐升高，48 h时转录水平有所下调，60 h时再次升高。
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图 3 PRRSV mRNA转录水平注/Note: **. P<0.01。Figure 3. The transcription levels of PRRSV mRNA2.4 PAMs中IFN-γmRNA转录水平
由图4可知：PRRSV组IFN-γ的mRNA转录量在感染后6~48 h逐渐升高，48 h时达到最大值，在6 h时IFN-γ mRNA转录水平显著低于正常对照组，24、48 h时显著高于对照组IFN-γ mRNA转录水平，到60 h又恢复到正常对照组水平。
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图 4 IFN-γ mRNA在各组不同时间点的转录水平注/Note: **. P<0.01。Figure 4. The transcription levels of IFN-γ mRNA in each group at different time points2.5 PAMs中IRF3和IRF7mRNA转录水平
运用qPCR方法检测不同处理组IRF3和IRF7 mRNA相对转录量。根据2−ΔΔCt可以得出对照组的数据为1。结果(表2)显示：PRRSV组中IRF3的mRNA转录量在6、12、24 h时低于正常对照组，48 h时转录水平高于正常对照组IRF3的 mRNA转录量，而到60 h时又显著低于正常对照组；PRRSV组IRF7的mRNA转录量在24 h时达到最大值且显著高于对照组，但在12、48、60 h时均显著低于正常对照组。
表 2 IRF3和IRF7 mRNA在各组不同时间点的转录水平Table 2. The transcription levels of IRF3 and IRF7 mRNA in each group at different time points基因
gene培养时间/h culture time 6 12 24 48 60 IRF3 0.56±0.055 0.62±0.165 0.97±0.014 1.12±0.082 0.49±0.155* IRF7 1.02±0.189 0.43±0.066** 1.48±0.246** 0.41±0.034** 0.55±0.038** 注：与同一时间点的对照组比较，*.P<0.05，**.P<0.01。
Note: Compared with control group at the same time, *.P<0.05, **.P<0.01.2.6 IFN-γ与IRF3和IRF7 mRNA转录水平相关性分析
如图5所示：PRRSV组IFN-γ与IRF3和IRF7 mRNA转录水平相关系数分别为|R|=0.96和|R|=0.04。根据|R|∈[0.1, 0.3)为弱相关，|R|∈[0.3, 0.5)为中等相关，|R|∈[0.5, 1.0]为强相关，得出IFN-γ与IRF3基因mRNA转录水平呈强正相关与IRF3基因呈正相关。
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图 5 PRRSV组IFN-γ与IRF3和IRF7基因转录水平相关性分析Figure 5. IFN-γ and IRF3 and IRF7 correlation with the transcription in PRRSV groups3. 讨论
PRRSV感染机体后出现的免疫学症状与适应性免疫应答的低效表达有关。研究表明：由病毒诱导产生的特异性IFN-γ可作为细胞免疫功能评价的重要指标，用于病毒感染后宿主免疫机制的研究[9]。本研究运用qRT-PCR和ELISA检测PRRSV感染PAMs后对IFN-γ的影响发现：PRRSV组IFN-γ mRNA转录水平在24、48 h时显著高于对照组，这一结果与前人研究的用PRRSV感染从支气管肺泡灌洗液中分离得的细胞后，其IFN-γ表达水平高于感染前的表达水平的结果[10]相类似。但IFN-γ的生成量与对照组相比却无显著性差异。研究发现：不同毒力的PRRSV毒株诱导IFN-γ的能力存在差异[11]。PATRICIA等[10]和HAN等[12]的研究发现：PRRSV高致病性毒株刺激IFN-γ生成的能力显著高于PRRSV经典毒株。IFN-γ主要是由活化的CD4+Th1 、CD8+T细胞产生，巨噬细胞产生IFN-γ的能力较弱。
IRF3和IRF7是主要的抗病毒转录因子，无论机体通过何种模式识别受体或何种信号通路来识别病原体，最终均能活化IRF3和IRF7。研究发现：PRRSV的Nsp1、Nsp2、Nsp11、结构蛋白N和GP5蛋白可以通过不同的途径来抑制IRF3的产生，尤其对于猪肺泡巨噬细胞和单核细胞等易感细胞[13-15]。本研究运用qRT-PCR检测PRRSV感染PAMs后对IRF3和IRF7的影响发现：PRRSV组中IRF3的mRNA转录水平随着感染时间的延长逐渐升高，但均低于对照组，IRF7mRNA转录水平在12、48、60 h时显著低于对照组，说明PRRSV体外感染PAMs后可抑制IRF3和IRF7 mRNA转录水平。另外，本研究发现PRRSV组中IFN-γ mRNA转录水平与IRF3 mRNA转录水平存在强正相关关系，与IRF7 mRNA存在弱正相关关系。研究表明：IFN-γ能增加巨噬细胞的吞噬作用和促进MHCI及II类分子的表达，提高抗原递呈功能[16]。
本研究表明：PRRSV在感染PAMs过程中不刺激IFN-γ的分泌，但对IFN-γ mRNA的转录在24 h内抑制，后上调其转录水平，在60 h时又被抑制。
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图 1 24 h各组细胞的观察(200×)
Figure 1. PAMs in different treatment groups for 24 h under inverted microscope
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图 2 不同时间点不同处理IFN-γ质量浓度(ρ)变化
Figure 2. The change of IFN-γ mass concentrations at different time points
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图 3 PRRSV mRNA转录水平
注/Note: **. P<0.01。
Figure 3. The transcription levels of PRRSV mRNA
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图 4 IFN-γ mRNA在各组不同时间点的转录水平
注/Note: **. P<0.01。
Figure 4. The transcription levels of IFN-γ mRNA in each group at different time points
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图 5 PRRSV组IFN-γ与IRF3和IRF7基因转录水平相关性分析
Figure 5. IFN-γ and IRF3 and IRF7 correlation with the transcription in PRRSV groups
表 1 荧光定量PCR引物序列
Table 1 Real-tine PCR primer sequences
基因gene 引物序列 primer sequence 退火温度/℃ T m 目的片段/bp fragment size β-actin F:5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′ 52 122 R:5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT -3′ PRRSV F:5′-GTCAGACATCACTTTACCCCTAG-3′ 60 123 R:5′-CTCCACAGTGTAACTTATCCTCC-3′ IFN-γ F:5′-GGCCATTCAAAGGAGCATGG-3′ 60 147 R:5′-AGTTCACTGATGGCTTTGCG-3′ IRF-3 F:5′-GGTGCCTACACTCCTGG-3′ 60 105 R:5′-GTGGTCCTCTGCTAAACG-3′ IRF-7 F:5′-CGCCTCCTGGAAAACCAA-3′ 60 76 R:5′-CCCTGAGTTGTCCTGCAACA-3′ 
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表 2 IRF3和IRF7 mRNA在各组不同时间点的转录水平
Table 2 The transcription levels of IRF3 and IRF7 mRNA in each group at different time points
基因
gene培养时间/h culture time 6 12 24 48 60 IRF3 0.56±0.055 0.62±0.165 0.97±0.014 1.12±0.082 0.49±0.155* IRF7 1.02±0.189 0.43±0.066** 1.48±0.246** 0.41±0.034** 0.55±0.038** 注：与同一时间点的对照组比较，*.P<0.05，**.P<0.01。
Note: Compared with control group at the same time, *.P<0.05, **.P<0.01.
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