不同插穗规格和季节对米槁扦插生根的影响
Effect of Different Cutting Sizes and Seasons on the Cutting Rooting of Cinnamomum migao
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Keywords:
- cuttings size /
- season /
- Cinnamomum migao
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YOU等[1]于1996年首次成功克隆出鸡的FSHR cDNA。FSH (follicle stimulating hormone，促卵泡素)基因对雌性动物卵泡的生长发育、分化和成熟起重要作用，但需通过FSHR (follicle stimulating hormone receptor，促卵泡素受体)基因的介导来实现其生物学功能。FSH是垂体前叶分泌的调控动物繁殖活动的糖蛋白质激素，它能促进性腺的发育和成熟，对动物卵巢的卵泡发育、成熟和排卵具有重要作用[2-3]。雌性动物中，FSHR位于卵泡颗粒细胞膜上，FSHR与促卵泡素FSH结合，通过G蛋白偶联机制激活酶，使细胞内CAMP增加或Ca2+内流增加，从而对细胞代谢或功能活动产生影响。基因敲除实验发现：FSHR基因可以促进动物的卵巢发育、卵泡发生、FSH的分泌等[4]。
FSHR基因是影响繁殖性状和生长性状的重要基因，在一些禽类动物上对FSHR基因的研究已有一些报道。该基因定位于鸡的3号染色体，含有10个外显子和9个内含子，全长77 664 bp[5]。杨孔等[6]研究发现：藏鸡和罗曼鸡的FSHR外显子1、4具有多态性，这2个外显子核苷酸突变位点的等位基因频率和基因型频率在藏鸡和罗曼鸡之间呈极显著差异，该基因的SNP与产蛋量具有显著相关性。李亨等[7]研究发现：文昌鸡FSHR基因外显子1~9和两侧内含子区域上存在4个SNP位点，推测其可作为分子标记。
迄今，对无量山乌骨鸡FSHR基因的研究还未见报道。本研究对无量山乌骨鸡FSHR基因完整编码区序列进行了克隆，对多个组织进行了qPCR表达分析，在此基础上对其编码蛋白质理化特性、结构及功能进行了分析，为解析无量山乌骨鸡繁殖性状的遗传基础提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验样品
本研究样品采自云南省昆明市云南农业大学鸡场，采集成年健康无量山乌骨鸡的心、肝、脾、肺、肾、肌胃、脑、小肠、胸肌、腿肌、胸腺、法氏囊、卵巢、垂体等组织。样品低温带回实验室后，置于−80 ℃冰箱保存。
1.2 总RNA提取及cDNA合成
使用RNA提取试剂盒提取无量山乌骨鸡各组织的总RNA，用紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，选择质量较好的RNA样品参照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。
1.3 引物设计与目的片段扩增
根据NCBI数据库中已发表的普通鸡FSHR基因序列(登录号：NM_205079)采用Oligo 7软件设计2对引物用于扩增无量山乌骨鸡FSHR基因的完整编码区。设计特异性引物扩增目的片段：
F1：5′-CGCACTCCTTCCTTCTAGATG-3′；
R 1：5′-TGTAATACCGGCTTTTGGTC-3′；
F2：5′-CAAACTCACTGTACCTCGTT-3′；
R2：5′-TTATCACACTGCCTCAGACAC-3′。
设计用于荧光定量的特异引物扩增257 bp：F3：5′-CCTTCCCAAACTACATGAAATAAGA-3′；R3：5′-TATTTAGCCGTAGAATCACACTTTC-3′。
以β-actin基因为内参扩增225 bp，利用荧光定量法分析各组织的表达水平，引物如下所示：
F：5′-GTGTGATGGTTGGTATGGGC-3′；
R：5′-CTCTGTTGGCTTTGGGGTTC-3′。
1.4 RT-PCR分离FSHR基因
PCR反应总体系50 μL，采用TaKaRa Ex TaqE体系，琼脂糖凝胶电泳确定扩增的FSHR基因片段与引物设计时预期的片段大小吻合，胶回收后送公司测序。
1.5 序列组装及数据分析
利用DNAstar软件包对所得序列进行核对并识别序列的开放阅读框，进行编码区核酸序列组成分析，推导其对应的氨基酸序列。使用Mega 7.0软件进行物种间氨基酸序列比较分析。采用ProtParam tool、NCBI数据库中BLAST程序、ProtComp 9.0、SignaIP 4.1、TMHMM Server 2.0、SOPMA等软件分别预测FSHR基因编码氨基酸的分子量和等电点、FSHR蛋白的保守结构域、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构、二级结构。
2. 结果与分析
2.1 FSHR基因扩增结果
对FSHR基因编码区进行扩增，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。扩增片段长度与预期结果相符，F1/R1扩增片段长度为1 342 bp，F2/R2扩增片段长度为945 bp。
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图 1 无量山乌骨鸡FSHR基因RT-PCR产物注：M. DNA相对分子质量标准DL2000；1. F1/R1 PCR产物；2. F2/R2 PCR产物。Figure 1. RT-PCR products of Wuliangshan silky chicken FSHR geneNote: M. Marker-DL2000; 1. F1/R1 PCR product; 2. F2/R2 PCR product.2.2 FSHR基因分离鉴定
对测序所得序列进行开放阅读框查找，然后使用NCBI数据库进行同源搜索，确定其为无量山乌骨鸡FSHR基因序列。经过拼接组装，最终确定无量山乌骨鸡FSHR基因CDS区，长2 082 bp，编码693个氨基酸(图2)。
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图 2 无量山乌骨鸡FSHR基因CDS序列与编码的氨基酸序列注：ATG为起始密码子，下划线为保守结构域；第61~216位氨基酸处为LRR_5；第282~349位氨基酸处为GnHR超家族；第363~637位氨基酸处为7tm_GPCRs超家族。Figure 2. Coding sequence and amino acids sequence of Wuliangshan silky chicken FSHR geneNote: ATG. start codon; underline. conserved domain; 61-216 AA consist of LRR_5; 282-349 AA consist of GnHR superfamily; 363-637 AA consist of 7tm_GPCRs superfamily.2.3 FSHR蛋白质序列基本理化特性
对无量山乌骨鸡FSHR蛋白基本理化特性分析结果见表1。
表 1 无量山乌骨鸡FSHR蛋白的理化特性分析Table 1. The physicochemical properties analysis of Wuliangshan silky chicken FSHR protein特性characters 预测结果prediction results 特性characters 预测结果prediction results 等电点isoelectric point (PI) 8.85 分子式formula C3588H5632N930O979S39 分子量/ku molecular weight 78.7 不稳定系数instability index (II) 45.17 负电荷残基数
negatively charged residues (Asp + Glu)54 平均疏水性
grand average of hydropathicity (GRAVY)0.226 正电荷残基数
positively charged residues (Arg + Lys)69 脂肪系数
aliphatic index (AI)104.53 2.4 FSHR亚细胞定位及跨膜结构
无量山乌骨鸡FSHR蛋白定位于内质网上，概率为77.8%。FSHR含有4个胞外域、4个胞内域和7个跨膜结构域，是典型的7次跨膜蛋白。胞外域分别位于氨基酸序列的1~366、424~442、509~531和598~606等位点；跨膜结构域分别位于氨基酸序列的367~389、401~423、443~465、486~508、532~554、575~597和607~629等位点；胞内域分别位于氨基酸序列的390~400、466~485、555~574和630~693等位点(图3)。
2.5 FSHR蛋白保守结构域
预测结果显示：FSHR蛋白含有LRR_5超家族、GnHR超家族和7tm_GPCRs超家族等3个保守结构域(图4)。LRR_5位于第61~216位氨基酸处，GnHR超家族位于第282~349位氨基酸处，7tm_GPCRs超家族位于第363~637位氨基酸处。
2.6 FSHR二级结构和三级结构分析
由FSHR二级结构分析结果(图5)可知：α-螺旋占31.17% (含有216个氨基酸)，延伸链占26.26% (含182个氨基酸)，β转角占7.07% (含49个氨基酸)，无规则卷曲占35.50% (含246个氨基酸)。当α-螺旋<5%、延伸链>45%时为all-beta型；当α-螺旋>30%、延伸链>20%时为alpha-beta型；当α-螺旋>45%、延伸链<5%时为all-alpha型；其他情况为mixed型[8]。因此，无量山乌骨鸡FSHR蛋白的构型为alpha-beta型。
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图 5 无量山乌骨鸡FSHR蛋白二级结构Figure 5. The secondary structure of Wuliangshan silky chicken FSHR2.7 FSHR蛋白功能位点分析
预测结果显示：FSHR蛋白质含有6类功能活性位点，包括N-糖基化位点、N-肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酰胺化位点和酪氨酸激酶磷酸化位点(表2)。
表 2 无量山乌骨鸡FSHR蛋白功能活性位点分析Table 2. Functional active sites of Wuliangshan silky chicken FSHR protein功能位点putative functional sites 位置及氨基酸组成position and amino composition N-糖基化位点N-glycosylation site 47-50:NATE; 191-194:NGTC; 199-202:NLSD; 268-271:NFTY; 380-383:NTTV N-肉豆蔻酰化位点N-myristoylation site 64-69:GAftGL; 439-444:GAgcNA; 441-446:GCnaAG; 681-686:GTiySL 酪蛋白激酶II磷酸化位点casein kinase II phosphorylation site 78-81:SqnD; 193-196: TclD; 263-266:SliE; 313-316:SaaE; 564-567:SnsD 蛋白激酶C磷酸化位点protein kinase C phosphorylation sites 121-123:SlR; 249-251:TyR; 279-281:TnR; 305-307:TgK; 347-349:SpK; 555-557:TvR;
596-598:SlR; 632-634:TfR酰胺化位点amidation site 305-308:tGKR 酪氨酸激酶磷酸化位点tyrosine kinase phosphorylation site 677-684:Kns.DgtiY 2.8 FSHR序列同源性比较
将NCBI数据库下载的原鸡(NP_990410)、珍珠鸡(XP_021246584)、鸭子(XP_005012152)、鹅(XP_013047925)、白鹭(XP_009646499)、鹌鹑(XP_015712376)和大山雀(XP_015478711)的FSHR氨基酸序列与本研究的无量山乌骨鸡序列比对发现(表3)：各物种间FSHR基因编码的氨基酸序列较保守，无量山乌骨鸡与原鸡的同源性较高，为99.9%，与珍珠鸡、鸭子、鹅、白鹭、鹌鹑和大山雀的同源性分别为93.4%、90.2%、90.2%、88.2%、95.4%和87.4%。基于FSHR氨基酸序列，采用Mega 7.0。
表 3 无量山乌骨鸡与其他物种FSHR氨基酸序列一致性Table 3. Homologous of FSHR amino acids sequences of Wuliangshan silky chicken and other species物种
species无量山乌骨鸡
Wuliangshan silky chicken原鸡
gallus珍珠鸡
guinea fowl鸭子
duck鹅
goose白鹭
egret鹌鹑
quail大山雀
big tits无量山乌骨鸡Wuliangshan silky chicken * 99.9 93.4 90.2 90.2 88.2 95.4 87.4 原鸡gallus 0.1 * 93.2 90.0 90.0 88.0 95.2 87.3 珍珠鸡guinea fowl 7.0 7.1 * 92.3 92.9 91.8 95.2 90.2 鸭子duck 10.5 10.7 8.1 * 98.6 93.8 91.8 91.6 鹅goose 10.5 10.7 7.4 1.5 * 93.9 92.4 92.5 白鹭egret 12.9 13.1 8.7 6.5 6.3 * 90.6 93.2 鹌鹑quail 4.8 4.9 5.0 8.7 8.1 10.0 * 89.3 大山雀big tits 13.8 14.0 10.5 8.9 7.9 7.1 11.5 * 注：对角线以上数值表示一致性百分比，对角线以下数值表示代表分歧度。
Note: The values of the above diagonal line represent the identity percentage, below the diagonal represent divergence.根据氨基酸序列构建系统发育树(图6)，结果显示：原鸡、珍珠鸡、鹌鹑和无量山乌骨鸡聚为一类的支持率为68%；鸡形目物种聚为一类的支持率为100%。
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图 6 无量山乌骨鸡与其他物种FSHR氨基酸序列系统树Figure 6. Phylogenetic tree based on FSHR amino acids sequences of Wuliangshan silky chicken and other species2.9 实时荧光定量表达分析
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3. 讨论
FSHR参与卵泡的生长发育和分化成熟，与动物的繁殖性状存在一定的关联性。陈祥等[9]通过对其基因多态性及其mRNA的表达量研究第1外显子和第10外显子，均发现存在SNP位点。牛云超等[10]通过免疫组织化学法对处于卵泡期的成年母犬的卵巢、子宫、输卵管中FSHR进行免疫定位分析，研究FSHR在母犬生殖器官中的分布情况，发现不同的发情周期有不同的表达差异。FSHR的复杂结构决定其功能的多样。
保守结构域含有LRR_5超家族、GnHR超家族和7tm_GPCRs超家族，其中LRR_5超家族含有许多亮氨酸的重复序列，存在很多BSPA-like (BSPA，金黄色葡萄球菌A蛋白是细胞壁抗原的主要成分)表面抗原[11]。在真核生物中发现的GnHR超家族长约70个氨基酸，有2个完全保守的C残基端，在生物学功能上可能发挥着重要作用。这个家族包含促卵泡激素和促黄体生成激素(2种主要的促性腺激素受体)的跨膜区域。这些受体参与生殖细胞发育过程和成熟的G蛋白与受体偶联的过程[12]。7tm_GPCRs超家族是七跨膜G蛋白偶联受体超家族，通过G蛋白将生理信号从细胞外传递到细胞内。该家族成员参与种细胞外刺激，包括肽、脂质、神经递质、氨基酸、激素等。所有的G蛋白偶联受体都具有共同的结构，包括由3个细胞外和3个细胞内相互连接的7个跨膜螺旋[13]。
二级结构分析结果显示：FSHR主要为无规则卷曲和α螺旋，分别占35.50%和31.17%。蛋白质的空间结构很大程度上决定其功能。其中，无规则卷曲则构成酶活性部位和其他蛋白质的特异功能部位，对蛋白质的功能起着决定性作用，α螺旋主要对蛋白质骨架具有稳定性[14]。此外，FSHR的N端有17个氨基酸组成的信号肽，而ProtComp 9.0软件预测该蛋白77.8%的部分定位于内质网上，表明FSHR可能在内质网合成或者在细胞质中合成运输到内质网上。内质网可以运输细胞中的物质，也参与蛋白质修饰和加工，尤其糖基化较多。对无量山乌骨鸡FSHR功能位点进行预测，发现FSHR蛋白质含有6类功能活性位点，其中胞外区N端存在4个保守的糖基化位点，分别是(47-50)NATE、(191-194)NGTC、(199-202)NLSD和(268-271)NFTY。其中，磷酸化修饰对蛋白的结构和功能具有至关重要的作用，磷酸化与细胞的信号转导、细胞周期等息息相关[15]。对无量山乌骨鸡FSHR功能位点预测发现：该蛋白含有5个酪蛋白激酶II磷酸化位点、8个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点。其中酪蛋白激酶Ⅱ是酶类家族中的重要成员，催化蛋白磷酸化作用的过程，控制细胞生命活动[16]。酪蛋白激酶Ⅱ作为参与细胞信号转导的一种重要分子，通过对底物的磷酸化作用而影响机体的活动[16]。FSHR含有大量的磷酸化位点，可能与该基因在内质网上的原因有关。因此，FSHR可能在参与转运和结合、信号转导、翻译后修饰等方面具有重要作用。
对各物种FSHR蛋白序列进行同源性比较，其同源性在87.4%以上，无量山乌骨鸡与原鸡的同源性较高，分别为99.9%，表明FSHR高度保守。基于FSHR氨基酸序列构建的系统树结果表明亲缘关系较近的物种可能FSHR生物学功能较相似。
采用β-actin作为内参，对该基因进行实时荧光定量。在禽类中，通过对京海黄鸡FHSR基因在不同生长时期及组织中的表达情况进行研究，分别在4、16、20周龄进行定量分析，发现该基因在性腺中表达量最高[17]。另外，垂体的表达会随着鸡的生长周龄有稳定上升趋势。而笔者在无量山乌骨鸡的组织表达谱也发现，该基因在性腺卵巢中表达量最高，与文献结果一致，表明该基因可能主要在性腺中发挥功能。
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表 1 不同粗度插穗对扦插苗的生根性状的差异性分析
Table 1 Difference analysis of rooting characteristics of cuttings with different roughness cuttings
粗度/mm
roughness测定指标index 隶属函数数值
dinate
function values根系效果指数
rooting
effective index生根率/%
rooting rate愈伤组织形成率/%
callusing rate偏根率/%
hyponastic
root rate每穗生根数
rooting number
per spike最大根长/cm
the maximum
root length＞5 42.22±5.09 b 81.11±5.09 a 54.72±5.02 c 2.07±0.20 a 8.43±0.70 a 0.53 0.08 >4~5 33.33±3.33 c 60±5.77 b 65.28±4.81 ab 1.33±0.17 b 2.62±0.25 c 0.47 0.02 >3~4 57.78±1.92 a 76.67±3.33 a 70.24±5.46 a 1.29±0.14 b 5.4±0.46 b 0.50 0.03 >2~3 54.44±1.92 a 75.56±1.92 a 63.97±6.26 ab 1.53±0.12 b 4.73±0.40 b 0.50 0.02 注：各列间不同字母表示差异显著(P<0.05)。隶属函数值为生根率、生根数量、愈伤组织形成率、最大根长及偏根率各隶属函数值之均值；下同。Note: The different letters in the same columns indicate significant difference among treatments (P<0.05). Subordinate function values are the mean of rooting rate, rooting number, the maximum root length, callusing rate and hyponastic root rate; the same as below. 
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表 2 不同长度插穗对扦插苗的生根性状的差异性分析
Table 2 Difference analysis of rooting characters of cuttings with different length cuttings
长度/cm
length测定指标index 隶属函数数值
subordinate
function values根系效果指数
rooting
effective index生根率/%
rooting
rate愈伤组织形成率/%
callusing
rate偏根率/%
hyponastic
root rate根数/(条·穗−1)
rooting
number最大根长/cm
the maximum
root length18 28.89±5.09 b 38.89±5.09 b 58.53±5.20 b 1.40±0.15 a 2.63±0.26 c 0.53 0.04 15 33.33±3.33 b 45.56±5.09 b 62.11±4.76 ab 1.67±0.17 a 1.73±0.15 d 0.50 0.02 13 47.78±1.92 a 75.56±3.85 a 70.00±5.00 a 1.70±0.15 a 3.33±0.25 b 0.45 0.03 10 51.11±3.85 a 74.44±6.94 a 58.89±4.28 b 1.78±0.25 a 4.27±0.33 a 0.55 0.06 7 47.78±6.94 a 78.89±1.92 a 57.74±3.31 b 1.67±0.18 a 4.37±0.26 a 0.54 0.04
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表 3 不同季节插穗对扦插苗的生根性状的差异性分析
Table 3 Difference analysis of rooting characteristics of cuttings in different seasons
季节
season测定指标index 隶属函数数值
subordinate
function values根系效果指数
rooting
effective index生根率/%
rooting
rate愈伤组织形成率/%
callusing
rate偏根率/%
hyponastic
root rate根数/(条·穗−1)
rooting
number最大根长/cm
the maximum
root length3月March 55.56±1.92 a 78.89±5.09 a 57.29±4.77 a 2.17±0.19 a 7.87±0.65 a 0.55 0.08 6月June 24.44±3.33 b 37.78±1.92 c 59.03±3.18 a 1.75±0.25 a 3.80±0.36 b 0.49 0.04 9月September 48.89±5.09 a 66.67±3.33 b 59.52±5.46 a 1.80±0.22 a 4.81±0.38 b 0.48 0.05
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