促进滇重楼皂苷类活性成分积累的内生真菌筛选
Screening of Endophytic Fungi for Promote the Accumulation of Active Components of Saponins from Pairs polyphylla var. yunnanensis
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Keywords:
- Pairs polyphylla var. yunnanensis /
- endophytic fungi /
- ITS sequences
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由于滥用抗生素和微生物基因突变，抗生素耐药性细菌的增加已对全球人类健康造成严重威胁[1]。新型抗感染剂的探索和开发是近年来研究的热点，天然抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)被认为是设计新型抗生素的优秀模板。与传统抗菌剂相比，AMP具有广谱、快速的抗菌性，通常不诱导细菌耐药性，副作用少，且与传统抗生素结合能表现出协同活性[2]。目前，多种AMP已被批准用于临床应用和食品储存[3]，未来还可用作新型抗感染剂[4]。
节肢动物没有复杂的后天免疫系统，主要依靠体内合成的AMP抵御病原微生物入侵[5]。胡蜂是一类膜翅目昆虫，其毒囊是一种高度专一的防御和攻击器官。近年来，胡蜂蜂毒作为丰富的药理活性肽来源而备受关注[6]。研究表明：胡蜂蜂毒主要由酶、多肽、胺类以及其他蛋白组成，其中多肽主要包括胡蜂蜂毒肽(mastoparan，MP)、胡蜂化学趋向性肽(vespid chemotactic peptide，VCP)和肥大细胞脱颗粒肽(mast cell degranulating peptide，MCD)等[7-8]。MP在胡蜂蜂毒中的含量最丰富，是胡蜂蜂毒中非常重要的两性阳离子多肽，具有诱导肥大细胞脱颗粒活性，可促使组胺释放，从而引发炎症[9]。MP类多肽有抗菌活性，当MP单独使用或是将其与其他抗生素联合使用有较好的抗菌效果，可作为对抗多重抗生素耐药菌的有效疗法[10]。
凹纹胡蜂(Vespa velutina)隶属于胡蜂科(Vespidae)胡蜂属(Vespa)，在云南省境内分布广泛、养殖规模较大，是科学研究的良好材料。但已有研究大多集中于其生物学特性和入侵防治研究，对其体内多肽的研究很少[11]。本研究通过提取凹纹胡蜂毒囊中的RNA，反转录PCR构建cDNA文库；利用特殊引物筛选出目标基因，克隆目标基因后测序，并根据序列合成新多肽，再检测新多肽的抗菌活性和抗氧化性，以期为相关药物的开发奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
于凹纹胡蜂巢门口捕捉凹纹胡蜂100只，立即放入液氮中保存带回实验室。将胡蜂从液氮中取出，尽快剖开腹部取出毒囊，将毒囊放入EP管并保存于液氮备用。
1.2 RNA提取
使用TransZol Up Plus RNA Kit (TransGen，中国北京) 在超净台提取RNA；用BioPhotometer测定所得RNA含量，并将RNA置于−80 ℃冰箱保存。
1.3 毒腺cDNA文库构建
使用 SMARTTM cDNA Construction Kit (Clontech，加拿大) 合成cDNA，第1次PCR合成的cDNA用作第2次PCR的模板。根据NCBI中胡蜂天然抗菌肽前体肽的信号肽设计特殊引物S1：5′-ATGAAGTATATAGTTTG-3′，用于筛选编码AMP前体的cDNA；使用FastPure Extraction Mini Kit (Vazyme，中国南京) 回收PCR产物，并配以pMD19-T载体(TaKaRa，中国大连)；最后，将PCR产物克隆转载到大肠杆菌DH5α细胞中，并送北京博迈德基因技术有限公司测序。使用DNAMAN 10对测序数据进行分析，将目标碱基序列翻译成肽序列；然后在NCBI数据库中比对，找出新的多肽序列；由武汉百意欣生物技术有限公司根据基因片段合成多肽。
1.4 多肽生物活性检测
1.4.1 抑菌活性检测
试验用革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 25923、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ATCC 1965、粪肠球菌(Enterococcus faecalis) ATCC 29212；试验用革兰氏阴性菌包括大肠杆菌(Escherichia coli) ATCC 25922和肺炎克雷伯菌( Klebsiella pneumoniae) ATCC 10031。
检测方法：采用液体法进行测定。在96孔板中，分别加入上述5种试验菌液各50 μL，每种菌液各7孔；然后分别加入50 μL质量浓度为 6.25、12.50、25.00、50.00、100.00和200.00 μg/mL多肽溶液(溶剂：甲醇)，以加入甲醇的菌液作为空白对照。加入多肽或甲醇的菌液在37 ℃ 培养16~18 h，使用光度计(722N，上海仪电)测定其在600 nm处的吸光度，确定在各质量浓度下多肽能否抑制细菌生长，计算抑菌率：抑菌率=(A空白对照− A多肽样品)/A空白对照×100%。抑菌率>50%时，说明多肽有抑菌效果；抑菌率>90%时，说明多肽有较好抑菌效果。试验进行3次技术重复和3次试验重复。
1.4.2 抗氧化性检测
(1) 清除DPPH自由基能力检测
在96孔板中加入浓度为1×10−4 mol/L的DPPH甲醇溶液190 μL和不同质量浓度(5、10、20、50、100和200 μg/mL)的VV-VP-2溶液10 μL，混合均匀，以只加DPPH的孔为空白对照，加2 μg/mL维生素C溶液为阳性对照，加甲醇溶液为阴性对照。37 ℃孵化30 min，使用光度计测定517 nm处各样品的吸光度，并计算清除率：清除率=(A空白对照−A样品)/A空白对照×100%。试验进行3次技术重复和3次试验重复。
(2) 清除ABTS自由基能力检测
以甲醇为溶剂配置ABTS储备液(7.4 mmol/L)和K2S2O8储备液(2.6 mmol/L)，将5 mL ABTS储备液和88 μL K2S2O8储备液混匀，静置12~16 h，用甲醇稀释40倍制成ABTS工作液备用。在96孔板中加入ABTS工作液200 μL和不同质量浓度(5、10、20、50、100和200 μg/mL)的VV-VP-2溶液10 μL，静置6 min，使用光度计测定734 nm处各样品的吸光度；以只加ABTS工作液的孔为空白对照，加2 μg/mL维生素C溶液为阳性对照，加甲醇溶液为阴性对照。计算清除率：清除率=(A空白对照−A样品)/A空白对照×100%。
(3) 清除·OH自由基能力检测
向96孔板中加入不同质量浓度的VV-VP-2溶液 (5、10、20、50、100和200 μg/mL) 10 μL、蒸馏水70 μL、9.1 mmol/L水杨酸—甲醇溶液 10 μL、9 mmol/L FeSO4溶液10 μL和30%H2O2溶液10 μL，混匀后用光度计测定510 nm处的吸光度(A1)；用蒸馏水代替FeSO4溶液，用光度计测定510 nm处的吸光度(A2)；用蒸馏水代替多肽样品，用光度计测定510 nm处的吸光度(A3)。以加2 μg/mL维生素C溶液为阳性对照，甲醇溶液为阴性对照。计算清除率：清除率=[1−(A1−A2)/A3]×100%。试验进行3次技术重复和3次试验重复。
1.5 数据分析
测序结果使用Dnaman处理；活性检测数据使用Excel 2010进行整理，使用SPSS 20.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，数据用“平均值±标准差”表示；用Origin 9.0绘图。
2. 结果与分析
2.1 cDNA文库
在NCBI上对所得多肽序列进行比对，发现得到的多肽为Vespid chemotactic peptide (VCP)家族，从中发现1种新多肽，命名为VV-VP-2，其氨基酸序列为FFPIIAKLLGGFLGKK。
2.2 抑菌活性
由表1可知：100和200 μg/mL的多肽VV-VP-2对金黄色葡萄球菌有抑制作用，抑菌率分别为(51.7±4.0)%和(56.6±2.0)%；50、100和200 μg/mL的多肽VV-VP-2对肺炎克雷伯菌有抑制作用，抑菌率分别为(59.8±0.9)%、(63.8±3.6)%和(68.5±0.0)%。
表 1 新多肽在不同质量浓度下对5种细菌的抑制率Table 1. The inhibition rate of five types of bacteria by new peptide at different mass concentrations% 质量浓度/(μg·mL−1)
mass concentrantion革兰氏阳性菌
Gram-positive bacteria革兰氏阴性菌
Gram-negative bacteria金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis粪肠球菌
Enterococcus faecalis大肠杆菌
Escherichia coli肺炎克雷伯菌
Klebsiella pneumoniae200.00 56.6±2.0 47.3±3.0 35.8±2.2 46.4±1.3 68.5±0.0 100.00 51.7±4.0 44.4±4.2 NA 37.3±1.5 63.8±3.6 50.00 44.9±3.2 40.3±0.5 NA 34.0±4.2 59.8±0.9 25.00 46.8±1.9 39.7±2.3 NA 34.5±4.2 46.3±1.9 12.50 37.5±0.8 37.7±4.1 NA 29.6±0.7 41.7±3.8 6.25 37.3±3.3 37.1±1.4 NA 18.9±5.0 38.0±2.2 注：NA. 无抑菌效果。
Note: NA. no bacteriostatic effect.2.3 抗氧化活性
由图1可知：50、100和200 μg/mL的蜂毒多肽VV-VP-2对DPPH、ABTS和·OH自由基均有极显著的清除能力，说明>50 μg/mL的新多肽具有一定的抗氧化能力。其中，新多肽对DPPH自由基的清除率最高，说明新多肽对DPPH自由基有较好的抗氧化性。
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图 1 不同质量浓度新多肽对DPPH、ABTS和·OH自由基的清除率注：M. 甲醇，阴性对照；Vc. 维生素C溶液 2 mg/mL，阳性对照；“**”和“***”分别表示与阴性对照在0.01和0.001水平上有显著差异。Figure 1. The DPPH, ABTS and ·OH scavenging rate of new peptide at different mass concentrationsNote: M. methanol, negative control; Vc. vitamin C solution 2 mg/mL, positive control; “**” and “***” indicate significant differences from negative controls at 0.01 and 0.001 levels, respectively.3. 讨论
3.1 抑菌活性
多数节肢动物的毒液都可以分离出浓度和活性都较高的抗菌肽，对很多细菌和真菌都有抑制生长甚至是杀灭的作用[12]。这些多肽除了具有抗菌活性外，还具有一些其他生物学活性，如抗病毒活性、抗肿瘤活性和免疫调节活性等[13]。BAEK等[6]从黑胸蜾蠃(Orancistrocerus drewseni)和点蜾蠃(Eumenes pomiformi)的毒液中发现：VCP家族多肽OdVP1、OdVP2、EpVP1、EpVP2a和EpVP2b具有抗菌活性，对多种菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)为5~200 μmol/L；在黄胡蜂(Vespula lewisii)毒液中发现的Mastoparan对多种菌株的MIC为5~50 μmol/L[14]；从黑盾胡蜂(Vespa bicolor)毒液中分离出的多肽VESP-VB1和MP-VB1对多种标准菌株和抗药性菌株的MIC均在1~120 μg/mL[7]。本研究发现的凹纹胡蜂蜂毒新多肽VV-VP-2仅在50~200 μg/mL时对金黄色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌有一定抑制效果，对其他菌的抑菌效果较差，这可能与多肽溶液的质量浓度过低有关。与其他胡蜂的蜂毒多肽相比，本研究识别出的VV-VP-2抑菌效果一般，可通过对多肽序列进行修饰或与其他抗生素联合使用以提高抑菌效果。
3.2 抗氧化性
抗氧化剂包括天然抗氧化剂和化学合成抗氧化剂。化学合成的抗氧化剂 (如丁基羟基茴香醚和二丁基羟基甲苯等) 在抗氧化的同时会带来一些毒副作用。天然抗氧化肽具有毒副作用低和效率高等特点，成为国内外科研人员研究的热点。由基因编码的抗氧化肽目前主要在蛙科动物中发现。CAO等[15]从青蛙(Odorrana andersonii)皮肤中分离出的Cathelicidin-OA1在浓度为32 μmol/L时可清除90%的ABTS自由基，具有较强的抗氧化性；同种青蛙皮肤中分离出的OA-GL21在浓度为500 μmol/L时可清除约70%的ABTS[16]，抗氧化性较弱。从本研究识别出的新多肽对3种自由基的清除率来看，多肽VV-VP-2的质量浓度大于50 μg/mL时具有一定的抗氧化能力，但其质量浓度为200 μg/mL时(约为120 μmol/L)对3种自由基的清除率均未超过30%，与前述抗氧化肽相比抗氧化能力不强。因此，多肽VV-VP-2用于开发为抗氧化药物时，还需对其进行修饰进而增加其抗氧化能力。
本研究识别出的凹纹胡蜂蜂毒多肽VV-VP-2对部分试验菌株有明显抑制作用，并且有一定抗氧化能力。VV-VP-2可用于开发新型抗菌药物和新型抗氧化剂。但本研究仅找出了具有生物活性的新多肽，后续还需进一步开展动物试验、临床试验以及通过修饰和合成等方法运用多肽进行制药。目前，多肽已经在医药和生物技术领域得到了广泛的关注和应用，天然活性多肽药物的开发将会成为未来新药开发的重要部分。
4. 结论
本试验通过构建凹纹胡蜂蜂毒多肽cDNA文库，识别出新多肽VV-VP-2。该多肽具有一定的抗菌活性和抗氧化活性，为抗菌和抗氧化药物的开发提供了模板。
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图 1 有害内生菌以及有益内生菌与组培苗共生情况
注：a)、b)和c)在文中编号分别为：4-1、4-2和8-11，其表现为菌丝体发达吞噬滇重楼组培苗，这3种真菌与滇重楼组培苗共生表现在本试验中是最典型的；d)和e)在文中编号分别为8-13、8-6，其菌丝体的生长未对滇重楼组培苗产生有害影响，这2种真菌在本试验中与组培苗共生的表现是最典型的；CK. 对照组。
Figure 1. Harmful endophytic bacteria and beneficial endophytic bacteria with tissue culture seedlings symbiotic situation
Note: a), b) and c) are numbered in the text as follows: 4-1, 4-2 and 8-11. Their performance is that the mycelia developed and phagocytosed. The symbiotic performance of seedlings is the most typical in this experiment; d) and e) are numbered 8-13 and 8-6 respectively in the text. The growth of their mycelia has no harmful effect on the tissue culture seedlings of R. polyphylla var. yunnanensis. The symbiosis with tissue culture seedlings in this experiment is the most typical; CK. control group.
表 1 滇重楼组培苗与菌株接种效果比较
Table 1 Comparison of the inoculation effect between tissue culture seedlings and strain
菌株
fungi strain组培苗成活率/%
survival rate of tissue culture总皂苷含量/%
total saponin content真菌菌丝覆盖率/%
fungal mycelial coverage组培苗生长情况
growing situation of tissue culture8-15 33.33 0.642 100 部分叶片发黄，根部发黑。 4-4 33 0.518 100 同8-15 8-6 100 0.757 10 同CK 8-12 0 0.183 10 植株玻璃化、致死，根部发黑 6-6 0 0.066 100 根部发黑 8-16 0 0.368 100 同8-15 6-8 20 0.331 100 叶片发黄、变卷，根部发黑 8-11 0 0.460 100 植株被菌丝吞噬，根部正常 8-13 100 0.799 100 部分叶片发黄，根部正常。 8-3 80 0.405 100 部分叶片变成浅绿色，根部正常 8-2 40 0.337 100 同8-15 8-10 40 0.313 100 同8-15 8-9 40 0.471 100 同8-15 6-5 100 0.215 80 同CK 4-2 20 0.133 100 同8-15 8-7 80 0.323 100 同8-3 4-1 0 0.033 100 植株被菌丝吞噬，根部发黑 6-4 0 0.031 100 同4-1 8-5 33.33 0.561 100 同8-11 4-3 0 0.342 100 同8-11 8-1 0 0.044 100 同4-1 6-7 100 0 10 同CK 4-6 0 0 100 同8-11 CK 100 0 0 叶片发绿，根部正常 注：组培苗存活率=(该处理存活苗数量/该处理试验苗总数)×100%；菌丝覆盖率=(菌丝覆盖培养瓶的面积/培养瓶瓶底表面积)×100%。
Note: The survival rate of tissue culture seedlings = (the number of treatments to survive the number of seedlings/the total number of treatment seedlings) × 100%; mycelial coverage = (hyphae covered area of the culture bottle/bottle bottom surface area) × 100%.
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表 2 滇重楼与内生菌共生培养皂苷含量测定结果
Table 2 Dian heavy floor and endophytic bacteria symbiotic cultivation of saponins determination results
菌株
fungi strain总皂苷含量/%
total saponin content菌株
fungi strain总皂苷含量/%
total saponin content菌株
fungi strain总皂苷含量/%
total saponin content菌株
fungi strain总皂苷含量/%
total saponin content8-15 0.65±0.012 c 6-8 0.33±0.002 ij 8-9 0.47±0.004 f 8-5 0.56±0.006 d 4-4 0.52±0.002 e 8-11 0.47±0.006 f 6-5 0.22±0.002 l 4-3 0.34±0.001 i 8-6 0.76±0.003 b 8-13 0.81±0.012 a 4-2 0.14±0.004 n 8-1 0.05±0.001 p 8-12 0.18±0.008 m 8-3 0.41±0.003 g 8-7 0.32±0.004 j 6-7 0±0 s 6-6 0.07±0.002 o 8-2 0.34±.004 i 4-1 0.03±0.002 pq 4-6 0±0 s 8-16 0.37±0.003 h 8-10 0.31±0.002 k 6-4 0.03±0.002 r CK 0±0 s 注：同列数据后不同小写字母表示不同菌株处理下差异显著水平(P<0.01)。
Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant differences in the levels of different strains (P<0.01).
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