植物内生菌是在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物(主要为细菌和真菌)，它们有的附着于植物表面，有的生活于植物体内。早些年的研究大多是关于依附于植物表面的微生物，近年来，越来越多不同研究领域的学者把注意力集中到了生活于植物体内的微生物。自从1993年STROBEL^[1]首次报道了从短叶紫衫(Taxus brevifolia)的韧皮部中分离到1株能产紫杉醇的内生真菌以来，内生菌的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株。如枸杞是重要中药材，其生长环境要求高，一般需要3~5年的时间才能形成葫芦形根，有前人从葫芦形根中分离得到31种内生真菌，这些真菌或显著提高宿主植物生长，或增加三叶青扩展蛋白基因(Th-exp)的表达，或增加枸杞的黄酮含量^[2]；另外研究人员还从在重金属污染的土壤中生长的植物根系中分离出内生真菌，可以提高宿主植物的修复能力^[3]；从长春花中得到产长春碱的内生菌^[4-6]。因此，植物内生菌可能存在极大的潜在药物利用、开发等多重价值。

滇重楼(Pairs polyphylla var. yunnanensis)隶属于延龄科重楼属(Paris L.)植物，适宜在海拔1 400~3 100 m的常绿阔叶林、灌丛、背阴山中种植。滇重楼作为中国的重要中药材，其药用历史悠久，是西部地区最具代表性、占据产业化利用主导地位和全局影响力的重要药用植物资源之一^[7]，是云南白药、宫血宁、四川白药等一些重要中成药的主要组成成分。2015年版《中国药典》记载滇重楼地下块茎具有消肿止痛、清热解毒、活血散瘀、凉肝定惊等功效，可用于治疗蛇虫咬伤、惊风抽搐、跌打损伤等症^[8]，还具有抗癌、止血、祛痰、抑菌、抗早孕等作用^[9-10]。近年来随着滇重楼药用价值的深度开发利用，药用范围不断扩大，现有药源已远不能供应市场需求。野生资源有限加之生长周期较长，地下块茎的生长速度十分缓慢，需历经多年的生长累积，才能使种子生长为具有药用价值的成苗。块茎繁殖是滇重楼最快的繁殖方式，但其繁殖系数较低。部分研究报道了通过组织培养的方式得到滇重楼苗^[11]。但是，得到的组培苗数量并不可观，再者所得到的植株中药用成分的含量还有待进一步研究；也有学者通过处理土壤的pH值来提高滇重楼生长状况、各器官营养元素含量及块茎总皂苷含量^[12]；研究了不同钙水平对滇重楼生长、养分元素吸收和总皂苷含量的影响^[13]。

滇重楼中有益内生菌可与宿主植物产生互利效应，宿主植物因此受到很多影响，包括能产生甾体皂苷类化合物^[14]、增强滇重楼的抗病能力、抵御生长环境胁迫能力、提高滇重楼产率、转化或修饰滇重楼中活性次生代谢产物。王茜等^[15]的研究显示：从滇重楼块茎、根、叶中分离得到749株内生真菌，分别归属于41个属，其中尖孢镰刀菌、粘鞭霉属和曲霉属能产甾体皂苷的活性菌株^[16]；2008年宣群等^[17]从滇重楼全株中分离得到18株内生真菌，经鉴定为无孢菌群，并且从中筛选出了1株对白色念珠菌有抑菌作用；孙静贤等^[18]利用滤纸片法对分离自滇重楼的10株内生真菌进行抗菌活性检测，结果表明：其中的7株均对金黄色葡萄球菌有抑菌作用。但这些研究的重点在所分离内生菌的次生代谢物上，而关于内生菌能否促进滇重楼甾体皂苷的积累至今尚未有人涉及。

因此，本研究试图从内生菌对宿主是否有促生作用的角度来研究滇重楼内生菌的促生机理，为滇重楼微生物的再开发与利用等奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

1.1.1   供试菌种

从采自云南大理弥渡的十年生滇重楼苗地下块茎中分离出的23株菌株。

1.1.2   供试植株

由中科院昆明植物研究所林亮提供的滇重楼组培苗，为刚长出1片子叶类型。

1.2   培养基

内生真菌分离培养基采用含150 mg/L的硫酸链霉素和150 mg/L盐酸四环素的双抗PDA培养基^[19]，共生培养基为DE培养基^[20]。

1.3   试验方法

1.3.1   内生真菌的分离与纯化

将新鲜滇重楼块茎用自来水清洗干净表面的泥土，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分。置于超净台进行常规消毒，方案如下：75%乙醇消毒处理1 min，无菌水冲洗3次，0.2%砷汞消毒处理4 min，无菌水冲洗4次，接着用无菌水浸泡30 min，后用0.2%砷汞消毒处理2 min，无菌水冲洗4次，用无菌滤纸吸干水分待用。将消毒处理后的块茎用解剖刀切成2 cm大小的正方体，置于分离培养基平板内，28 ℃培养4~8 d。待菌长出后，平板划线纯化，直至得到单菌落，斜面保存备用。

1.3.2   内生真菌的分子学鉴定

采用CTBA法^[16]提取真菌基因组DNA。ITS扩增使用的通用引物为ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5 (5'-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3')，由上海生工生物工程公司合成。PCR反应体系为：10 μL 10 × PCR Buffer，0.25 μL dNTPs (10 mmol/L)，1 μL ITS4，1 μL ITS5，0.3 μL Taq酶，1 μL DNA模板，用ddH₂O补足50 μL。扩增程序: 94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，33个循环，72 ℃ 3 min，4 ℃保存。将经过琼脂糖凝胶电泳分析后的扩增产物送往上海生工生物工程公司测序。测序结果通过NCBI网上比对鉴定菌种所属种类。

1.3.3   组培苗的共生培养

在无菌超净工作台上，从长满菌落的PDA平板培养基上用手术刀切取4块含菌琼脂块^[21](直径0.5 cm左右)，分别置于培养瓶的4个角落。将苗取出用无菌水冲洗黏附在根上的培养基，无菌滤纸吸干水分，之后将苗根尖切出伤口后植入共生培养瓶中央。试验设不接种菌对照(CK)，接种上述23种菌株，共24个处理，每处理3株，重复3次。菌苗共生培养条件为置于25 ℃培养室中，光照12~14 h/d，光照强度1 500 lx，逐日观察菌及苗生长状况。40 d后将其取出烘干后利用高效液相色谱法测定皂苷含量。

2.   结果与分析

2.1   内生真菌的分离鉴定结果

本试验从十年生的滇重楼根茎中分离得到内生真菌23株，分别为：1株Alternaria sp.链格孢菌(编号：8-10)、3株Cylindrocarpon sp.人参生柱隔孢(编号：8-13、8-15、8-16)、1株Chaetomium globosum球毛壳菌(编号：6-7)、1株Chaetomium sp.毛壳属(编号：8-5)、4株Fusarium oxysporum尖孢镰刀菌(编号：4-1、6-6、8-1、8-12)、1株Fusarium redolens芳香镰刀菌(编号：6-4)、1株Fusarium sp.镰刀菌(编号：4-6)、2株Leptodontidiumsp.真菌(编号：4-3、4-4)、2株Plectosphaerella cucumerina真菌(编号：6-5、8-11)、1株Paraphaeosphaeria sporulosa真菌(编号：8-9)、1株Pyrenochaetasp.真菌(编号：8-7)、1株Penicillium chrysogenum青霉菌(编号：6-8)、1株Penicillium swiecickii真菌(编号：8-2)、1株Trichoderma viride木霉菌属(编号：8-6)、1株Trichoderma ovalisporum木霉菌属(编号：8-3)、1株Trichoderma gamsii木霉菌属(编号：4-2)。

2.2   内生真菌与滇重楼组培苗共培养结果

2.2.1   内生真菌对滇重楼组培苗生长情况的影响

滇重楼组培苗与23种菌株共培养40 d后，植株的生长情况见表1。有19株内生菌生长快且菌丝发达，其中4-1、4-2和8-11等5株的菌丝体缠绕植株，将植株吞噬(图1a~c)；其余内生菌菌丝平铺于培养基表面，虽然未吞噬植株，但导致植株玻璃化，最终死亡。8-13、8-6菌生长慢，菌丝不发达，与苗共生时，综合叶片以及根部生长情况，侵染效果较好(图1d、e)。对照组植株正常生长。

表  1  滇重楼组培苗与菌株接种效果比较

Table  1.  Comparison of the inoculation effect between tissue culture seedlings and strain

菌株 fungi strain	组培苗成活率/% survival rate of tissue culture	总皂苷含量/% total saponin content	真菌菌丝覆盖率/% fungal mycelial coverage	组培苗生长情况 growing situation of tissue culture
8-15	33.33	0.642	100	部分叶片发黄，根部发黑。
4-4	33	0.518	100	同8-15
8-6	100	0.757	10	同CK
8-12	0	0.183	10	植株玻璃化、致死，根部发黑
6-6	0	0.066	100	根部发黑
8-16	0	0.368	100	同8-15
6-8	20	0.331	100	叶片发黄、变卷，根部发黑
8-11	0	0.460	100	植株被菌丝吞噬，根部正常
8-13	100	0.799	100	部分叶片发黄，根部正常。
8-3	80	0.405	100	部分叶片变成浅绿色，根部正常
8-2	40	0.337	100	同8-15
8-10	40	0.313	100	同8-15
8-9	40	0.471	100	同8-15
6-5	100	0.215	80	同CK
4-2	20	0.133	100	同8-15
8-7	80	0.323	100	同8-3
4-1	0	0.033	100	植株被菌丝吞噬，根部发黑
6-4	0	0.031	100	同4-1
8-5	33.33	0.561	100	同8-11
4-3	0	0.342	100	同8-11
8-1	0	0.044	100	同4-1
6-7	100	0	10	同CK
4-6	0	0	100	同8-11
CK	100	0	0	叶片发绿，根部正常
注：组培苗存活率=(该处理存活苗数量/该处理试验苗总数)×100%；菌丝覆盖率=(菌丝覆盖培养瓶的面积/培养瓶瓶底表面积)×100%。 Note: The survival rate of tissue culture seedlings = (the number of treatments to survive the number of seedlings/the total number of treatment seedlings) × 100%; mycelial coverage = (hyphae covered area of the culture bottle/bottle bottom surface area) × 100%.

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图  1  有害内生菌以及有益内生菌与组培苗共生情况

注：a)、b)和c)在文中编号分别为：4-1、4-2和8-11，其表现为菌丝体发达吞噬滇重楼组培苗，这3种真菌与滇重楼组培苗共生表现在本试验中是最典型的；d)和e)在文中编号分别为8-13、8-6，其菌丝体的生长未对滇重楼组培苗产生有害影响，这2种真菌在本试验中与组培苗共生的表现是最典型的；CK. 对照组。

Figure  1.  Harmful endophytic bacteria and beneficial endophytic bacteria with tissue culture seedlings symbiotic situation

Note: a), b) and c) are numbered in the text as follows: 4-1, 4-2 and 8-11. Their performance is that the mycelia developed and phagocytosed. The symbiotic performance of seedlings is the most typical in this experiment; d) and e) are numbered 8-13 and 8-6 respectively in the text. The growth of their mycelia has no harmful effect on the tissue culture seedlings of R. polyphylla var. yunnanensis. The symbiosis with tissue culture seedlings in this experiment is the most typical; CK. control group.

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2.2.2   内生真菌对滇重楼组培苗皂苷类活性成分积累的影响

利用高效液相色谱法测定组培苗皂苷含量，总皂苷含量数据用Excel 2003进行整理，用SPSS statistics19.0软件进行方差分析。4-3、4-4同属于Leptodontidium sp.真菌，但是两者之间的皂苷含量还是有差异，4-4比4-3高18%； 6-8、8-2、8-7和4-3分别属于青霉菌、Penicillium swiecickii真菌、Pyrenochaeta sp.真菌、Leptodontidium sp.真菌，它们之间皂苷含量差异不显著，具体情况见表2。而其余菌株处理在方差分析上均呈极显著(P<0.01)。表2表明：8-13号菌株是提高滇重楼皂苷类活性成分积累效果最好的，其次是8-6号菌株，8-13比8-6高出5%。

表  2  滇重楼与内生菌共生培养皂苷含量测定结果

Table  2.  Dian heavy floor and endophytic bacteria symbiotic cultivation of saponins determination results

菌株 fungi strain	总皂苷含量/% total saponin content		菌株 fungi strain	总皂苷含量/% total saponin content		菌株 fungi strain	总皂苷含量/% total saponin content		菌株 fungi strain	总皂苷含量/% total saponin content
8-15	0.65±0.012 c		6-8	0.33±0.002 ij		8-9	0.47±0.004 f		8-5	0.56±0.006 d
4-4	0.52±0.002 e		8-11	0.47±0.006 f		6-5	0.22±0.002 l		4-3	0.34±0.001 i
8-6	0.76±0.003 b		8-13	0.81±0.012 a		4-2	0.14±0.004 n		8-1	0.05±0.001 p
8-12	0.18±0.008 m		8-3	0.41±0.003 g		8-7	0.32±0.004 j		6-7	0±0 s
6-6	0.07±0.002 o		8-2	0.34±.004 i		4-1	0.03±0.002 pq		4-6	0±0 s
8-16	0.37±0.003 h		8-10	0.31±0.002 k		6-4	0.03±0.002 r		CK	0±0 s
注：同列数据后不同小写字母表示不同菌株处理下差异显著水平(P<0.01)。 Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant differences in the levels of different strains (P<0.01).

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3.   讨论

本试验筛选出人参生柱隔孢是提高组培苗总皂苷含量效果最佳的菌株，而木霉菌是效果仅次于其的菌株，并且总皂苷含量都超过了部分研究的三年生滇重楼苗^[22]。其中木霉属是已经报道过的从滇重楼块茎中分离出的内生菌，并且有研究发现木霉分离物可以直接影响病原体，甚至诱导宿主植物产生某种激素类型，增强宿主植物抗逆境胁迫能力^[23]。木霉菌是一类很普遍的真菌，经研究具有病原菌拮抗作用、促生作用和对有机污染进行修复的作用等。至今木霉属的界定虽仍被质疑，但并不影响它作为未来的研究热点以及重点对象。生产中利用木霉属真菌促生作用的试验对象多为瓜果蔬菜类，并且试验环境为土壤病原菌被限制或消除。若在自然环境中大规模推广使用木霉属真菌，因田间大环境的复杂性，可能试验结果将会出现差异。因此，对于开发利用木霉菌的促生作用还应多试验、多总结，将其充分利用，力争为发展有机农业、节约化肥资源提供有价值的参考。而人参生柱隔孢与滇重楼的关系并未见对此有所报道^[24]。早在2002年有研究发现：人参生柱隔孢对长白山人参和西洋参锈病有较弱的致病作用^[25]。而本研究结果表明：其具有促进滇重楼合成皂苷类活性成分的作用，其中原因还有待进一步研究，但至少对人参生柱隔孢的作用有了进一步的认识。

本试验中检测组培苗皂苷含量时只能检测到皂苷Ⅶ，而有研究对不同年限滇重楼皂苷含量测定中，二年生的滇重楼苗都有含量很低的皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ和皂苷Ⅶ^[22]；其中原因还有待进一步研究。

关于植物内生菌与宿主植物进行共培养的研究多集中在兰科植物如石斛、金线莲等。这些研究结果证明了内生菌对宿主促生有重要作用。2016年杨玲玲^[26]对滇重楼内生细菌进行全面分析和挖掘，发现根瘤菌是优势类群之一，并对其开展了深入的系统发育基因组学研究。因此，我们有理由相信，本研究中的滇重楼内生菌对滇重楼有效成分的促生具有广阔的发掘潜力。