猪雄性增强抗原1基因MEA1编码区克隆、表达及生物信息学分析
Coding Sequence Cloning, Expression and Bioinformatics Analysis of Swine Male Enhancer 1 Gene
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雄性增强的抗原-1基因(the male-enhanced antigen-1 gene，MEA1)最初是从用抗雄性小鼠血清细胞构建的原核表达cDNA文库中分离获得[1]。分析其结构，发现MEA1基因序列侧面有2个基因：Ppp2r5d和Peas，使得Peas-MEA1-Ppp2r5d 成为1个基因复合体[2]。有研究报道MEA1基因位于人6号染色体，位于小鼠17号染色体，位于牛23号染色体，在哺乳动物系统发育过程中是比较保守的[3]。通过原位杂交，揭示了MEA1在生精管上皮细胞的粗线期高表达[4]。免疫组化分析显示该基因在精子生成后期发生转录[4]。在小鼠的研究中表明：MEA1在睾丸中明显高表达，在心脏、肝脏、大脑中微量表达[5]。Northern-blot结果显示：该基因编码大约1.5 kb的单个转录本，当葡萄糖、棉子糖或果糖存在的情况下，有表达量[6]。MEA2被报道在小鼠的精母细胞中表达[7]。通过分析该基因的SNP位点及其与生精过程中各个激素指标的相关性，其中两个位点可作为选育性欲较强的雄性动物的分子标记[8]。
版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line，BMI)作为一个大型哺乳动物近交系，其遗传背景较为清楚，生理、病理特征与人类相似，在临床医学、人类疾病模型、异种器官移植等方面有一定的价值[9-13]。但是在正常繁育BMI的37年来，有多个亚系断代，前期研究发现是部分公猪不育造成的，这些不育公猪已成为阻碍其群体进一步扩大的障碍，因此对版纳微型猪近交系雄性不育的研究很有必要。由于MEA1基因在哺乳动物精子生成后期发挥着重要作用，本研究通过克隆版纳微型猪近交系MEA1基因，确定其序列特征；进而对蛋白质进行功能生物信息学分析预测其功能，通过mRNA的多组织表达谱确定其发挥功能的重要组织，对该基因在BMI公猪精子生成方面的功能研究奠定一定的基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
屠宰云南农业大学版纳微型猪近交系实验猪场的成年公猪，取睾丸和附睾(性腺)，前列腺、精囊腺和尿道球腺(副性腺)，5种雄性生殖重要相关组织；取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃脏、脑、肌肉、十二指肠(小肠)、结肠(大肠)等常规组织；共15种组织样品。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取和第一链cDNA合成
参照说明书利用柱式RNA提取试剂盒(TaKaRa：9767)分别提取各组织总RNA，检测所提RNA的浓度、纯度及完整性，合格样品按反转录试剂盒(TaKaRa：6210A)操作说明书反转录为第一链cDNA保存备用。
1.2.2 引物设计及合成
根据GenBank下载的猪(NM_001110429)、牛(NM_174648)、小鼠(NM_001277309)、人(NM_014623)等物种的MEA1 mRNA序列，结合猪表达序列标签EST序列(CF176017、CJ008523、CK452977、FS670642、HX242707)，利用Oligo 7软件设计F1/R1特异引物(F1: AGGCTAAAGCTGGGCCTAAT，R1:AACCAGGATGCGTTCAGTCC)来扩增MEA1基因665 bp，其中包括全长CDS及部分5′和3′侧翼序列；设计F2/R2特异引物(F2: CCAGGATCGAATCCAGGCCTTG，R2: CGTGTTCTGGGTCCATGGGAAT)扩增125 bp，并以GAPDH基因为内参(F: CCTTCATTGACCTCCACTACATGGT，R: CCACAACATACGTAGCACCAGCATC)扩增183 bp，利用荧光定量法分析各组织的表达水平。
1.2.3 RT-PCR分离MEA1基因和生物信息学分析
PCR反应总体系25 µL，采用TaKaRa Ex TaqE体系，琼脂糖凝胶电泳确定扩增的MEA1基因片段与引物设计时预期的片段大小吻合，胶回收后测序。利用Lasergene软件中的SeqMan程序进行组装、拼接、并人工校对，确定BMI MEA1基因编码序列并提交GenBank数据库，同时推导出其编码的氨基酸序列并进行生物信息学分析。
1.2.4 MEA1基因多组织表达分析
以50 ng/μL的睾丸cDNA为模板，5倍倍比连续稀释获得7个标准品，以F2/R2为引物，制作标准曲线。以各组织cDNA为模板，以GAPDH为内参进行多组织qPCR表达水平检测。
2. 结果与分析
2.1 MEA1基因RT-PCR级序列分析结果
以BMI睾丸组织cDNA为模板，扩增的MEA1基因长度为665 bp (图1)。将F1/R1扩增产物测序结果使用DNAStar软件中的SeqMan程序进行组装，获得BMI MEA1全长编码序列525 bp，GenBank登录号为KU705641，推测其包含174个氨基酸，对应的氨基酸登录号为AOC89059，含有1个完整的保守结构域MEA1，属于MEA1超家族(图2)。
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图 1 MEA1基因反转录PCR扩增结果注：M. DL 2000 DNA分子量标准；1. MEA1 PCR产物。Figure 1. The RT-PCR result of MEA1 geneNotes: M. DL 2000 DNA Marker; 1. MEA1 PCR product.![]()
图 2 MEA1基因序列与氨基酸序列注：ATG表示起始密码子；上面一行字母和下面一行字母分别表示核酸序列和其对应的氨基酸序列；“*”表示终止密码子。Figure 2. The gene sequence and amino acids sequence of MEA1Notes: ATG. start codon; the upper line letters represent nucleotide sequence; “*”. stop codon.2.2 MEA1基因组结构分析
为了获得BMI MEA1基因座的基因组DNA，利用获得的BMI MEA1 CDS序列作为种子序列，在NCBI数据库中进行BLAST搜索，找到1个含有MEA1 CDS全长的猪种混合染色体序列(Sus scrofa chromosome 7，GenBank登录号：NC_010449.5)。利用在线的ensembl分析BMI MEA1基因的外显子/内含子结构，结果表明：BMI MEA1基因长2 368 bp，含有4个外显子和3个内含子，外显子—内含子剪接均符合GT-AG规则(图3)。
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图 3 BMI MEA1基因组、mRNA和蛋白结构Figure 3. Genomic organization, mRNA and protein domain structure of BMI MEA1 gene2.3 MEA1蛋白质生物信息学分析结果
2.3.1 MEA1蛋白质基本信息
BMI MEA1蛋白质基本信息见表1。
表 1 MEA1蛋白质的基本信息Table 1. Primary information of MEA1 protein一级结构特性
primary structure characteristics预测结果
prediction results氨基酸数the number of amino acids 174 分子量/ku molecular weight 18.77 等电点isoelectric point 3.98 分子式formula C812H1249N219O285S4 正电荷残基 positively charge residues 8 负电荷残基 negative charge residues 38 疏水性hydropathicity −0.705 不稳定系数instability index 60.84 2.3.2 MEA1蛋白质二级结构信息
BMI MEA1蛋白质二级结构包含54个氨基酸构成的α-螺旋结构(31.03%)，95个氨基酸构成的无规则卷曲结构(54.60%)，14个氨基酸构成的延伸链结构(8.05%)，11个氨基酸构成的β-转角结构(6.32%)。
2.3.3 MEA1蛋白质的疏水性
BMI MEA1蛋白质N端疏水，C端亲水，且在第7位置有最大疏水值1.798，在第44位置有最小疏水值−3.289。
2.3.4 MEA1蛋白质功能活性位点分析
BMI MEA1蛋白质包含N-糖基化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点和N-豆蔻酰化位点3种功能位点(表2)。
表 2 MEA1蛋白质3种功能活性位点Table 2. The three functional active sites of MEA1 protein活性位点名称active site 序列号sequence No. 氨基酸位置amino acids position N-糖基化位点N-glycosylation sites PS00001 19~22：NQTE；116~119：NHSS 酪蛋白激酶II磷酸化位点casein kinase II phosphorylation sites PS00006 38~41：SseE；103~106：SedE N-豆蔻酰化位点N-myristoylation site PS00008 50~55：GTgpAG 2.3.5 MEA1蛋白质N端信号肽及跨膜螺旋
MEA1蛋白质不包含N端信号肽序列，不存在跨膜螺旋，是非跨膜蛋白。
2.3.6 MEA1蛋白质序列多物种系统进化分析
利用MEGA 7.0软件将BMI MEA1的蛋白质序列与绵羊(XP_004018879)、人(NP_001305871)、长臂猿(XP_012351797)、黄牛(NP_777073)和牦牛(XP_005900181)等蛋白质序列进行了相似性比对，结果显示相似度分别为96.6%、96.5%、96.0%、94.8%和94.8%。并构建6个物种的分子系统进化树(图4)。
2.4 MEA1基因表达分析
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图 5 MEA1基因多组织相对表达水平注：1. 心；2. 肝；3. 脾；4. 肺；5. 肾；6. 胃；7. 脑；8. 肌肉；9. 十二指肠；10. 结肠；11. 精囊腺；12. 前列腺；13. 尿道球腺；14. 睾丸；15. 附睾。Figure 5. Relative expression level of MEA1 gene in multi-tissuesNote: 1. heart; 2. liver; 3. spleen; 4. lung; 5. kidney; 6. stomach; 7. brain; 8. muscle; 9. duodenum; 10. colon; 11. seminal vesicle gland; 12. prostate; 13. urethral ball glands; 14. testis; 15. epididymis.3. 讨论
鉴于部分公猪不育已成为阻碍其群体数目继续扩大的主要瓶颈，为了尽可能繁育更多亚系，对其精子发生相关基因的研究尤为重要。近年来对于MEA1基因的结构与功能的研究越来越深入，通过SCOTT等[14]的研究发现：MEA1可能是血清学检测的雄性候选抗原之一，也可能是睾丸特异表达基因，还可能是位于白细胞抗原和组织相容性抗原之间的重叠抗原基因，但在版纳微型猪近交系的研究中尚属空白。因此，通过生物信息学分析MEA1的氨基酸构成、C端和N端氨基酸的特性，以及这些氨基酸形成的功能位点、功能域，还有卷曲折叠构成的二级结构等是很有必要的。
蛋白质的结构与功能之间存在必然联系[15]，功能生物信息学分析显示BMI MEA1蛋白质二级结构中无规则卷曲和α螺旋含量较高，分别为54.60%和31.03%，无规卷曲是构成酶重要活性部位和蛋白质特异功能部位的二级结构元件，而α螺旋是蛋白质二级结构中最常见、含量也较为丰富的结构元件[15]。MEA1蛋白含有1个完整的保守结构域，属于MEA1超家族。
BMI MEA1蛋白无N端信号肽序列，表明其属于非分泌蛋白，可直接进入到细胞质基质中发挥其功能。MEA1蛋白无跨膜螺旋表明其属于非跨膜蛋白。化学修饰是蛋白质翻译后加工的重要内容，N-糖基化在蛋白质折叠、运输等过程中扮演着重要角色，蛋白质磷酸化可以大大提高酶蛋白的活性，它们是蛋白质化学修饰的两种重要方式，发现MEA1蛋白存在N-糖基化功能位点、酪蛋白激酶II磷酸化功能位点、N-豆蔻酰化位点，为今后深入进行MEA1蛋白的功能奠定了基础。
通过比对BMI猪、绵羊、人、长臂猿、黄牛和牦牛等物种的MEA1氨基酸序列，发现其相似性均在90%以上，说明该基因保守性较高。这几个物种MEA1蛋白质序列构建的系统进化树表明，牛和羊聚为一类，牛和羊均属于偶蹄目牛科动物，牛和羊是人类驯化较早的家养动物；人和长臂猿聚为一类，然后与猪聚为一类，MEA1基因编码的氨基酸与人类同源性更高，保守性更好，该基因在BMI中发挥的作用可能与人类更相似，有望对人类疾病的探索提供一定的理论依据。
实时荧光定量多组织表达谱分析表明：MEA1基因在BMI性腺睾丸中高表达，在其他组织中微量表达，由此推断该基因主要在猪的睾丸中发挥重要功能。睾丸是很重要的雄性生殖器官之一，可产生精子，分泌雄激素，产生睾丸液，维持精子的生成及存活[16]。据报道，MEA1基因已在小鼠[4]中进行扩增并对多组织的表达情况进行了实验鉴定，该基因在睾丸中明显高表达。我们研究发现MEA1基因在猪睾丸中也是高表达，其结果一致，说明该基因在睾丸组织中起着很重要的作用。
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图 1 MEA1基因反转录PCR扩增结果
注：M. DL 2000 DNA分子量标准；1. MEA1 PCR产物。
Figure 1. The RT-PCR result of MEA1 gene
Notes: M. DL 2000 DNA Marker; 1. MEA1 PCR product.
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图 2 MEA1基因序列与氨基酸序列
注：ATG表示起始密码子；上面一行字母和下面一行字母分别表示核酸序列和其对应的氨基酸序列；“*”表示终止密码子。
Figure 2. The gene sequence and amino acids sequence of MEA1
Notes: ATG. start codon; the upper line letters represent nucleotide sequence; “*”. stop codon.
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图 3 BMI MEA1基因组、mRNA和蛋白结构
Figure 3. Genomic organization, mRNA and protein domain structure of BMI MEA1 gene
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图 5 MEA1基因多组织相对表达水平
注：1. 心；2. 肝；3. 脾；4. 肺；5. 肾；6. 胃；7. 脑；8. 肌肉；9. 十二指肠；10. 结肠；11. 精囊腺；12. 前列腺；13. 尿道球腺；14. 睾丸；15. 附睾。
Figure 5. Relative expression level of MEA1 gene in multi-tissues
Note: 1. heart; 2. liver; 3. spleen; 4. lung; 5. kidney; 6. stomach; 7. brain; 8. muscle; 9. duodenum; 10. colon; 11. seminal vesicle gland; 12. prostate; 13. urethral ball glands; 14. testis; 15. epididymis.
表 1 MEA1蛋白质的基本信息
Table 1 Primary information of MEA1 protein
一级结构特性
primary structure characteristics预测结果
prediction results氨基酸数the number of amino acids 174 分子量/ku molecular weight 18.77 等电点isoelectric point 3.98 分子式formula C812H1249N219O285S4 正电荷残基 positively charge residues 8 负电荷残基 negative charge residues 38 疏水性hydropathicity −0.705 不稳定系数instability index 60.84 
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表 2 MEA1蛋白质3种功能活性位点
Table 2 The three functional active sites of MEA1 protein
活性位点名称active site 序列号sequence No. 氨基酸位置amino acids position N-糖基化位点N-glycosylation sites PS00001 19~22：NQTE；116~119：NHSS 酪蛋白激酶II磷酸化位点casein kinase II phosphorylation sites PS00006 38~41：SseE；103~106：SedE N-豆蔻酰化位点N-myristoylation site PS00008 50~55：GTgpAG
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