棘胸蛙(Quasipaa spinosa)主要分布于中国东南部山区和越南北部地区^[1]，是中国重要的药食同源动物^[2-3]，其营养价值高，被美誉为“百蛙之王”。近年来，由于栖息地的人为破坏、除草剂等农药的广泛使用及过度捕捉，棘胸蛙野生资源不断减少，现已被国际自然保护联盟(IUCN)和中国红色名录列为易危物种^[4-5]。人工养殖是保护棘胸蛙资源的有效措施之一^[6]，棘胸蛙雄性个体的经济性能优于雌性，实现棘胸蛙的全雄养殖前景广阔。

两栖动物的性别由基因决定，但也受温度和外源性激素等因素的影响^[7-10]。温度的作用一般表现为高温诱导两栖动物后代性比向雄性偏移，而低温则会导致后代雌性化^[7-8]。外源性类固醇激素也会影响两栖动物的性别比率^[9-10]。研究发现：投喂含有17α-甲基睾酮的饲料会显著提高棘胸蛙蝌蚪后代的雄性率，但也会导致棘胸蛙生长受抑制，死亡率和畸形率显著上升^[11]。因此，寻找一种高效、安全的雄性诱导方法具有重要意义。

芳香化酶是一种类固醇合成酶，可以催化雄性激素转化为雌性激素，而芳香化酶抑制剂通过抑制其活性，可以直接调节两栖动物的内源性类固醇激素水平，诱导后代性别比向雄性偏移，甚至可以完全雄性化，具有比外源性激素更好的调节效果^[12-13]。来曲唑作为第3代芳香化酶抑制剂，具有对芳香化酶更高的选择性和抑制潜力^[14]，但其在两栖动物中的相关研究较少^[15]。本试验以棘胸蛙为研究对象，通过投喂含有不同来曲唑含量的饲料，研究来曲唑对其生长、性比及性激素(雌二醇和睾酮)水平的影响，以期为棘胸蛙全雄育种提供理论基础。

1.   材料与方法

1.1   试验动物

试验用棘胸蛙蝌蚪均来自湖南省常德市正兴农业开发有限公司岩蛙繁养基地，由同一批次受精卵孵化而来。

1.2   试验设计及样品采集

参照沈志刚^[16]的研究方法，将来曲唑(购自上海贤鼎生物科技有限公司)用无水乙醇溶解后，与黑斑蛙人工饲料(宁波天邦股份有限公司，粗蛋白含量≥38.0%、粗脂肪含量≥3.3%、粗纤维含量≤4.0%、粗灰分含量≤18.0%、水分≤4.0%、总磷含量≥1.0%、赖氨酸含量≥1.9%)拌匀，分别配制成20、100、400和1000 mg/kg的药饵；对照组加入等量无水乙醇。4 ℃冰箱保存备用。

养殖试验水温(19±1) ℃，微流水养殖。将刚脱膜开口后的15 000尾蝌蚪(平均每尾0.11 g)随机分成5组，每组3个重复，每个重复1 000尾，养殖于1个养殖池 (3.0 m×3.0 m×0.2 m) 中，共15个养殖池。5个组分别投喂对照和不同来曲唑含量的饲料，分别记为CK、L₂₀、L₁₀₀、L₄₀₀和L₁₀₀₀组，投喂周期为90 d，之后各组投喂正常饲料至变态完成。

在蝌蚪孵化后20、30、40、50、60和70 d时，从各组随机取6尾大小一致、体质量相近(±0.1 g)的蝌蚪置于液氮中速冻，保存于−80 ℃冰箱备用。蝌蚪变态完成后从各组中随机取30尾以上幼蛙备用。

1.3   变态幼蛙生长指标及性别比例的测定

随机从各组中取幼蛙20只(雌雄各10只)进行生长指标的测定。幼蛙在解剖前用吸水纸吸干体表水分，使用电子天平称其体质量，使用游标卡尺测量体长、头长、头宽、前臂及手长和后肢全长；解剖后参照图1鉴定性别，计算性比；分离肝脏后称其质量，计算肝体比。

图  1  棘胸蛙变态完成时精巢 (左) 和卵巢 (右) 的形态特征

Figure  1.  Morphological characteristics of testis (left) and ovary (right) of Quasipaa spinosa at the completion of the metamorphosis

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1.4   棘胸蛙蝌蚪雌二醇和睾酮水平的测定

由于棘胸蛙蝌蚪提取血液较难，故采用全组织匀浆进行激素水平的测定。每个时期取6尾蝌蚪，每尾为1个样本，采用酶联免疫法(ELISA)测定棘胸蛙蝌蚪全组织匀浆中的雌二醇(E₂)和睾酮(T)含量。E₂和T酶联免疫分析(ELISA)试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司，按使用说明书进行性激素水平的测定。

1.5   数据处理

利用Excel 2013进行数据统计，采用SPSS 25.0进行双因素方差(two-way ANOVA)分析，当方差分析差异显著(P<0.05)时，通过Duncan氏法对生长指标和性激素水平数据进行多重比较；采用卡方(χ²)检验对性别比例进行差异显著性分析。试验数据均采用“平均值±标准差”表示。

2.   结果与分析

2.1   来曲唑对棘胸蛙幼蛙生长的影响

由表1可知：添加不同来曲唑含量的饲料饲养后，雌雄幼蛙的体长、头长、头宽、前臂及手长、后肢全长和肝体比等生长指标与CK组相比均无显著差异，说明来曲唑对棘胸蛙幼蛙的生长无影响。

表  1  来曲唑对棘胸蛙幼蛙生长指标的影响

Table  1.  Effects of letrozole on the growth indicators of young Quasipaa spinosa

性别 sexuality	组别 group	体长/mm SVL	头长/mm HL	头宽/mm HW	前臂及手长/mm FL	后肢全长/mm HLL	肝体比/% HSI
雌性 female	CK	21.80±0.45	6.20±0.09	8.39±0.32	9.38±0.12	31.56±0.84	3.55±0.18
	L20	22.67±0.49	6.52±0.09	8.48±0.12	9.63±0.18	32.17±0.47	3.51±0.07
	L100	22.11±0.36	6.41±0.03	8.30±0.01	9.54±0.08	32.46±0.86	3.24±0.25
	L400	22.14±0.64	6.42±0.02	8.59±0.09	9.58±0.06	32.64±0.70	3.30±0.12
	L1000	21.68±0.57	6.51±0.31	8.51±0.20	9.43±0.07	32.02±1.81	3.19±0.22
雄性 male	CK	22.60±0.12	6.27±0.09	8.68±0.02	9.34±0.01	32.25±1.40	3.58±0.13
	L20	22.12±0.20	6.46±0.15	8.58±0.26	9.36±0.05	32.36±0.05	3.34±0.08
	L100	22.50±0.42	6.48±0.08	8.47±0.12	9.29±0.10	32.62±0.21	3.23±0.30
	L400	21.86±0.49	6.43±0.19	8.59±0.09	9.43±0.27	32.95±1.63	3.50±0.29
	L1000	22.49±0.75	6.46±0.09	8.40±0.16	9.28±0.11	32.50±0.43	3.45±0.28
显著性 significance		ns	ns	ns	ns	ns	ns
注：ns. 无显著影响 (P>0.05)；n=10。 Note: ns. no significant effect (P>0.05). SVL. snout-vent length; HL. head length; HW. head width; FL. forearm and hand length; HLL. hindlimb length; HSI. hepatosomatic index.

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2.2   来曲唑对棘胸蛙幼蛙性比的影响

由表2可知：CK组雄性率较低，为33.33%，显著低于4个来曲唑含量添加的饲料组，但不同来曲唑含量饲料组之间无显著差异。

表  2  来曲唑对棘胸蛙幼蛙性比的影响

Table  2.  Effects of letrozole on the sex ratios of young Q. spinosa

组别 group	取样数量 sample size	雌雄比 female-male ratio	卡方值 χ2 value	雄性率/% male rate
CK	30	20∶10	−	33.33 a
L20	53	22∶31	13.98	58.49 b
L100	38	17∶21	7.27	55.26 b
L400	43	22∶21	3.98	48.84 b
L1000	44	19∶25	9.89	56.82 b
注：χ20.05 (1) =3.84，不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

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2.3   来曲唑对棘胸蛙蝌蚪性激素水平的影响

由图2可知：与对照组相比，不同来曲唑含量处理组的雌二醇(E₂)和睾酮(T)水平均显著上升，但各来曲唑含量处理组之间无显著差异。由图3可知：从原始性腺到出现精巢分化期间 (20~50日龄)，来曲唑添加组的E₂水平与CK组相比均显著性上升，且增幅与来曲唑含量之间无明显关联；到60日龄时，来曲唑添加组的E₂水平下降至与CK组无显著差异；到70日龄时，L₂₀和L₁₀₀组的E₂水平与CK组无显著差异，但L₄₀₀组和L₁₀₀₀组的E₂水平显著低于CK组。此外，从原始性腺到性腺分化结束期间(20~70日龄)，除60日龄的L₂₀₀和L₁₀₀₀组外，其余各时期、各来曲唑添加组的T水平均与CK组有显著差异；30日龄(卵巢分化前)时，各来曲唑添加组的T水平显著低于CK组，其余各时期、各来曲唑添加组的T水平均显著高于CK组，但T水平的变化程度与来曲唑含量无关。

图  2  不同处理棘胸蛙蝌蚪的雌二醇(E₂)和睾酮(T)水平

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同。

Figure  2.  Estradiol (E₂) and testosterone (T) levels of Q. spinosa in different groups

Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05); the same as below.

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图  3  来曲唑对不同日龄棘胸蛙蝌蚪雌二醇(E₂)和睾酮(T) 水平的影响

Figure  3.  Effects of letrozole on the estradiol (E₂) and testosterone (T) levels of Q. spinosa at different day age

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3.   讨论

3.1   来曲唑对棘胸蛙幼蛙性别比例和生长指标的影响

芳香化酶抑制剂通过抑制雄性激素转化为雌性激素，能够使物种后代性别比例向雄性偏移。本研究投喂含有不同来曲唑含量的饲料均可显著提高棘胸蛙幼蛙的雄性率，且各来曲唑处理组变态后代的生长指标与CK组均无显著差异，说明来曲唑在提高雄性率的同时不影响棘胸蛙变态幼蛙的生长。

棘胸蛙蝌蚪高温偏向雄性，低温趋向雌性^[17]。本试验条件下[(19±1) ℃]，棘胸蛙偏向雌性发育，导致CK组雄性率较低(33.33%)。虽然来曲唑饲料能够显著提高棘胸蛙蝌蚪后代的雄性率，但与其他两栖动物相比，来曲唑对棘胸蛙雄性率的提升效果有限。OLMSTEAD 等^[12]研究发现：法倔唑可以使非洲爪蟾后代出现100%雄性；同样地，福美斯坦也可以诱导普通跳蛙蝌蚪后代出现全部雄性^[18]；投喂0.1和1.0 mg/g的来曲唑饲料可分别使虎纹蛙蝌蚪后代雄性率显著提高至83.6%和92.4% (对照组雄性率54.9%)，且雄性率随来曲唑含量的增加而增加^[15]，但本研究中，不同来曲唑含量之间的雄性率无显著差异。来曲唑不会影响两栖类物种的生长^[15]，但可提高棘胸蛙蝌蚪后代的雄性比例。因此，在未来棘胸蛙单性育种研究中，来曲唑诱导仍然是使棘胸蛙雄性化的重要方法。

3.2   来曲唑对棘胸蛙蝌蚪性激素水平的影响

性激素对两栖类性别分化具有重要作用，但影响机制尚不清楚。本研究中，20~70日龄期间，棘胸蛙E₂和T水平都发生显著变化，其中，卵巢分化前期(20~30日龄) E₂水平显著上升，精巢分化期间(40~50日龄) T水平显著上升，说明E₂和T都对棘胸蛙的性别分化产生了影响，但二者之间与性别的关系尚不清楚。

对非洲爪蟾^[12]的研究表明：蝌蚪持续(受精后到变态完成)暴露于1~64 μg/L法倔唑后，两性幼蛙血清中E₂和T质量浓度与对照组相比均无显著差异。对鱼类的研究发现：投喂含有芳香化酶抑制剂的饲料可显著降低鱼类血清E₂水平^[13]。来曲唑能够直接抑制芳香化酶活性，减缓雄性激素向雌性激素转化的速率，但同时芳香化酶抑制剂也会使物种发生代偿反应，通过代偿性上调芳香化酶基因表达和蛋白质翻译、增加其他参与类固醇激素合成基因的表达，使物种E₂水平上升^[19-20]。在本研究中，70日龄时L₄₀₀和L₁₀₀₀组的E₂水平显著降低，而T水平在大多数情况下都显著升高，说明来曲唑对棘胸蛙性激素水平产生了直接作用，但由于代偿作用，20~50日龄期间不同来曲唑处理组E₂水平较对照组上升。40~50日龄期间，不同来曲唑处理组的T水平显著高于对照组，这与棘胸蛙在46日龄开始精巢分化(另文发表)以及来曲唑能提高蝌蚪雄性率相符；同时，由于各来曲唑处理组间的T水平差异不显著，导致各来曲唑处理组的雄性率差异也不显著。

4.   结论

养殖水温为(19±1) ℃时，投喂添加不同来曲唑含量的饲料，不会影响棘胸蛙幼蛙的生长；通过显著提高棘胸蛙蝌蚪体内的睾酮水平，能够显著提高其后代雄性率，但与来曲唑的含量无关。未来可以搭配适当高温以及其他雄性化激素作进一步研究，以挖掘来曲唑在棘胸蛙全雄育种研究中的潜力。