黄绿绿僵菌Ma130821菌株的分子鉴定及产孢特性研究
Identification and Conidial Production Characteristics of the Metarhizium sp. Strain Ma130821
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水环境是水生生物的生存环境，良好的水质是水生生物健康生存的基础，水质变化导致的应激不仅会影响水生动物，同时也会影响病原菌，增加疾病发生的风险。疾病的发生是环境—病原—宿主间相互作用的结果，目前已有大量研究报道了水生动物在温度、pH、氨氮与亚硝酸盐等环境因子胁迫下对病原的易感性增强[1-2]，也有研究表明环境因子如温度、渗透压、pH、活性氧、氮化合物和无机离子浓度等因子对细菌毒力也有明显影响[3]，如18 ℃时香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)对大黄鱼的致病性强于25 ℃，此时细菌T6SS和铁摄取系统相关基因的表达较25 ℃显著上调[4]；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)毒力基因溶血素(AHH)、气溶素(AerA)、外膜蛋白(OMP)和黏附素(Aha)在15 ℃与pH 7.0时高效表达，但在4 ℃与pH 9.0时则受到抑制[5]。pH不仅影响细菌毒力基因的表达，也会对细菌增殖、生物膜形成和胞外产物(extracellular products，ECPs)活性与致病性产生重要影响。研究表明：嗜水气单胞菌最适生存pH值为6.5[6]，当环境pH值低于4时不能形成生物膜[7]，pH 7.5时其分泌的ECPs酶活性最强，且对对虾和鲫鱼等有较强的致病性[8]。
拟态弧菌(Vibrio mimicus)广泛存在于水环境中，可感染鳌虾、蟹、龟和多种鱼类，尤其对以黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)和南方鲇(Silurus meridionalis)等为代表的淡水鲇形目鱼类危害最为严重[9]。目前对于该菌的主要毒力因子种类、胞外产物和基因组特性[10]、感染鱼类的病理损伤特点及病原的分布规律[11]等进行了较为深入的研究，这些研究为阐释拟态弧菌的致病机制提供了重要的支撑。pH是一项重要的水质指标，其变化对拟态弧菌感染与致病相关特性的影响尚不清楚，因此，本研究在水生动物正常生长的pH范围 (6.0~9.0)内，研究不同pH对拟态弧菌感染相关表型及胞外产物特性的影响，以期为进一步揭示其感染与致病机制提供依据，同时也为养殖生产中通过调节水体pH来防控拟态弧菌病提供参考。
1. 材料与方法
1.1 菌种与试验动物
拟态弧菌SCCF01株由四川农业大学鱼病研究中心保存；供试斑马鱼购自成都某斑马鱼养殖基地，体长(2.95±0.20) cm。
1.2 主要试剂
LB培养基、琼脂、卵黄琼脂和明胶购自青岛海博生物有限公司；M199培养基购自HyClone；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；CCK-8细胞活性检测试剂购自上海生工生物科技有限公司。
1.3 pH对拟态弧菌感染相关表型的影响
1.3.1 对增殖的影响
采用吸光光度法测定pH对拟态弧菌增殖的影响。分别取新鲜拟态弧菌菌液(OD600=1.0) 500 μL接种于50 mL不同pH (6.0、7.0、8.0、8.5和9.0)的LB肉汤(n=3)，振荡培养，每2 h测量OD600值，连续测量24 h，绘制生长曲线。
1.3.2 对泳动的影响
分别取新鲜拟态弧菌菌液0.5 μL接种于不同pH (6.0、7.0、8.0、8.5和9.0)且含0.3%琼脂的LB半固体培养基(n=3)，28 ℃静置培养48 h后测量菌圈直径。
1.3.3 对自聚集的影响
采用吸光光度法检测菌株的自聚集。分别取新鲜拟态弧菌菌液100 μL接种至10 mL不同pH (6.0、7.0、8.0、8.5和9.0)的LB肉汤(n=3)，28 ℃静置培养48 h，测定上清液OD600值，并计算自聚集率。自聚集率=[1－(At/A0)]×100%，式中：At为特定时间的吸光度；A0为初始吸光度[12]。
1.3.4 对生物膜形成的影响
参考LUO等[13]的方法，采用微孔板法检测生物膜形成。分别取新鲜拟态弧菌菌液10 μL加入不同pH (6.0、7.0、8.0、8.5和9.0)的190 μL LB肉汤(n=3)，静置培养48 h，经结晶紫染色、无菌磷酸缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗和醋酸溶解后测定OD570值。
1.4 pH对拟态弧菌胞外产物(ECPs)特性的影响
1.4.1 对ECPs蛋白质量浓度的影响
分别取新鲜拟态弧菌菌液(OD600=1.0) 4 mL 接种至不同pH (6.0、7.0、8.0、8.5和9.0)的400 mL LB肉汤(n=3)，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h后调整各组拟态弧菌菌液OD600值为1.0；采用饱和硫酸铵法[14]提取拟态弧菌 ECPs，并采用PBS定容至1 mL，通过BCA蛋白浓度检测试剂盒测量其蛋白质量浓度。
1.4.2 对 ECPs酶活性的影响
采用琼脂扩散法[14]检测ECPs的酪蛋白酶、卵磷脂酶和明胶酶活性。ECPs质量浓度为0.25 mg/mL，加样量为30 μL；28 ℃正置培养24 h后分别测量平板透明圈直径。
1.4.3 对ECPs溶血性的影响
采用微量板法检测溶血性[14]。将ECPs质量浓度调至1.0 mg/mL后连续稀释2倍，每孔加入等量1%小鼠红细胞，37 ℃孵育1 h后在4 ℃条件下孵育过夜，以50%以上的红细胞被溶解作为判定标准测定溶血效价(即使50%红细胞溶解的样品最高稀释度)。
1.4.4 对ECPs细胞毒性的影响
参考DHARANEEDHARAN等[15]的方法，用M199培养基(含L丙氨酸-L-谷氨酸)将ECPs质量浓度调整至1.0 mg/mL后，加入铺满鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprini，EPC)的细胞瓶，以M199培养基为阴性对照，在25 ℃恒温培养箱中静置过夜，采用CCK-8试剂盒检测细胞活性。
1.4.5 对ECPs毒力的影响
将斑马鱼120尾随机分为6组，每组20尾。试验组分别注射不同pH条件下培养的拟态弧菌ECPs (1.0 mg/mL)，每尾腹腔注射50 μL；对照组腹腔注射等量无菌PBS。每隔12 h观察1次，试验期7 d。
1.5 pH对拟态弧菌转录水平的影响
根据感染相关表型与胞外产物特性的研究结果，选择毒力较强(pH 7.0)与毒力较弱(pH 8.5)条件下培养的拟态弧菌进行转录组分析。细菌在28 ℃、130 r/min培养18 h后将OD600值调为1.0，取50 mL提取总RNA后送至上海美吉生物科技有限公司进行转录组测序，提取方法参考JIA等[16]，每个处理设置3个生物学重复。使用Bowtie2将读码映射到V. mimicus SCCF01 (登录号：CP016383.1)的参考基因组，差异基因筛选标准为P<0.05，log2FC≥2。采用fasta软件进行数据质控，采用DEseq2进行基因间差异表达分析，所有分析均使用上海美吉生物科技有限公司的I-Sanger 云平台(www.i-sanger.com)进行。
1.6 数据统计与分析
所有数据使用Excel与GraphPad Prism进行统计与处理。
2. 结果与分析
2.1 pH对拟态弧菌感染相关表型的影响
由图1可知：随着pH的升高，拟态弧菌的增殖先增强后减弱，泳动呈减弱趋势，而自聚集和生物膜形成呈先减弱后增强的趋势。环境pH 6.0时，拟态弧菌在增殖12 h后进入平台期，pH 7.0时增殖10 h进入平台期，pH 8.0~9.0均在约8 h进入平台期，pH 8.5时增殖速度最快；pH 6.0时拟态弧菌的泳动、自聚集和生物膜形成均显著强于其他pH (P<0.05)，pH 8.5时最弱。
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图 1 不同pH培养后拟态弧菌的感染特性注：a) 增殖，b) 泳动性，c) 自聚集，d) 生物膜形成；不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，下同。Figure 1. Infection characteristics of Vibrio mimicus after cultured in different pHNote: a) proliferation, b) swimming motility, c) self-aggregation, d) biofilm formation; different lowercase letters indicate significant differences among groups (P<0.05), the same as below.2.2 pH对拟态弧菌ECPs特性的影响
2.2.1 对ECPs蛋白质量浓度的影响
由表1可知：pH 6.0时ECPs蛋白质量浓度最高，pH 7.0时ECPs蛋白质量浓度次之，pH 9.0时提取的ECPs蛋白质量浓度最低。
表 1 不同pH培养拟态弧菌后提取的ECPs质量浓度Table 1. Mass concentration of extracellular products of Vibrio mimicus in different pH culturespH c/(mg·mL−1) 6.0 3.11±0.11 a 7.0 2.82±0.10 a 8.0 2.52±0.15 a 8.5 1.82±0.13 b 9.0 1.72±0.12 b 注：不同小写字母表示组间差异显著 (P<0.05)。
Note: Different lowercase letters indicate significant differences among groups (P<0.05).2.2.2 对ECPs酶活性、溶血性和细胞毒性的影响
由图2可知： 随着pH的升高，ECPs酶活性和溶血性呈波动变化，但细胞毒性呈现逐渐减弱的趋势。pH 6.0时，ECPs酶活性强于其他pH处理，但溶血性较弱，效价为1∶16；pH 7.0 时，ECPs酶活性仅次于pH 6.0处理，卵磷脂酶活性与pH 6.0时无显著差异，溶血效价为1∶32；pH 8.0时，ECPs酶活性最弱，但溶血性最强，效价为1∶256；pH 8.5时溶血性最弱，溶血效价为1∶8；pH 9.0时，明胶酶活性最弱，溶血效价为1∶16。各pH条件下培养拟态弧菌的ECPs对EPC都具有明显的细胞毒性，与M199组的OD450值相比差异显著(P<0.05)，且随pH的升高OD450值增大，ECPs细胞毒性逐渐减弱。
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图 2 ECPs酶活性、溶血性与细胞毒性注：a) 酶活性；b) 溶血性；c) 细胞毒性。Figure 2. In vitro enzymatic activity, hemolytic and cytotoxicity of ECPsNote: a) enzyme activity; b) hemolytic; c) cytotoxicity.2.2.3 对ECPs毒力的影响
由图3可知：pH对拟态弧菌ECPs的毒力具有明显的影响，pH 6.0与pH 7.0 ECPs攻毒斑马鱼后6 h开始死亡，死亡鱼均表现为胸鳍基部、腹部出血，肛门红肿，攻毒后12 h死亡率为100%；pH 8.5 ECPs攻毒后8 h开始死亡，12 h后停止死亡，试验结束时死亡率为30%；pH 8.0与pH 9.0 ECPs攻毒12 h后开始死亡，试验结束时死亡率为50%。
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图 3 ECPs对斑马鱼的致病性注：a) 攻毒后斑马鱼症状；b) 斑马鱼生存曲线。Figure 3. Pathogenicity of extracellular products to zebrafishNote: a) symptoms of zebrafish after challenge; b) zebrafish survival curve.2.3 pH对拟态弧菌转录水平的影响
2.3.1 转录组原始数据质控评估
vm7-1、vm7-2、vm7-3、vm8.5-1、vm8.5-2和vm8.5-3转录组数据的测序产量如表2所示，其碱基数均大于2 G。Q20均大于98%，表明本试验测序数据质量合格，可以进一步对基因表达情况进行定量分析。
表 2 pH 7.0和pH 8.5处理拟态弧菌转录组测序数据质量评估Table 2. Quality assessment of V. mimicus transcriptome sequencing data at pH 7.0 and pH 8.5样品
samplemRNA长度/bp
length of mRNA原始数据质量评估/%
quality assessment of raw data测序产量/bp
clean reads待分析碱基数
clean basesQ20 Q30 vm7-1 124.6 98.77 96.26 27165408 3385676131 vm7-2 123.5 98.88 96.55 26983066 3332774405 vm7-3 125.0 98.61 95.85 27141086 3391786776 vm8.5-1 117.5 98.90 96.58 28449398 3343764073 vm8.5-2 118.8 98.82 96.37 28241014 3354626322 vm8.5-3 121.3 98.76 96.26 27863870 3378879868 2.3.2 差异表达基因统计与KEGG富集分析
分析结果显示：pH 8.5与pH 7.0培养的拟态弧菌转录结果相比，共有47个基因表达有显著性差异(图4a)，其中包括16个上调基因和31个下调基因(图4b)。根据差异基因的 KO编号将基因分别注释到KEGG通路，结果(图4c)显示：差异基因主要富集于碳水化合物代谢、核苷酸代谢、膜转运和翻译等过程。
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图 4 差异基因富集分析注：a) 差异基因火山图；b) 差异基因柱形图；c) 差异基因富集KEGG代谢通路。Figure 4. Enrichment analysis of differential geneNote: a) differential gene volcano plot; b) differential gene bar chart; c) differential gene enrichment KEGG metabolic pathway.2.3.3 基因表达量差异分析
分析差异基因表达显示：与pH 7.0处理相比，拟态弧菌pH 8.5处理后部分基因表达上调，但更多的基因表达显著下调(图5a)。pH 8.5时，拟态弧菌参与碳水化合物代谢和能量代谢过程中的糖酵解和氧化磷酸化相关基因(3-磷酸甘油脱氢酶vm16550和pdhR等)以及参与转运调控的DeoR家族蛋白和铜离子转运蛋白等基因表达显著上调(P<0.05) (图5b~f)；而参与核苷酸代谢和辅助因子与维生素代谢的腺苷酸激酶vm10210、磷酸核糖基甘氨酰胺甲酰基转移酶vm03760以及参与翻译和转运过程的核糖体装配基因rspN、外膜蛋白ompW和前蛋白转位酶亚基secY等基因表达显著下调(P<0.05) (图5g~j)。
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图 5 差异基因表达量分析注：a) 显著差异基因整体表达情况；b)~f) 显著上调基因；g)~j) 显著下调基因。“**”表示差异极显著(P<0.0l)。Figure 5. Analysis of differential gene expression levelsNote: a) the overall expression of significantly different genes; b)-f) significantly up-regulated genes; g)-j) significantly down-regulated gene; “**” indicates extremely significant difference (P<0.0l).3. 讨论
环境变化影响微生物的数量与分布，研究表明：创伤弧菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌等致病性弧菌的数量与生存环境变化密切相关，低温、低盐和低磷酸盐环境中的弧菌丰度较低、数量较少；水温在20 ℃以上、环境中离子强度、盐度和酸碱度适宜的环境中弧菌种类丰富[17]。不同弧菌最适生长pH不同，霍乱弧菌为pH 7.1，而副溶血弧菌为pH 8.0[18]，本研究pH在6.0~8.5范围内，随着pH升高，拟态弧菌增殖力逐渐上升，pH 8.5时增殖力最强。一般认为细菌致病性取决于细菌的入侵数量与毒力，虽然本研究未开展pH对拟态弧菌黏附和入侵力影响的测定，但发现在pH 8.0~8.5条件下，拟态弧菌的ECPs蛋白质量浓度、酶活性及其对斑马鱼的毒力相对较低。ECPs是细菌重要的毒力因子，其中的多糖等物质可帮助病原黏附在宿主表面，蛋白酶等破坏组织和器官等完整性，从而协助病原吸附和入侵，并在宿主体内繁殖、免疫逃避和扩散[19]。本研究表明：不同pH条件下，拟态弧菌产生ECPs特性具有明显差异，尤其是pH 8.5时其毒力最弱，这可以作为养殖生产中开展水质pH调控抵御拟态弧菌感染的参考。
生物膜也称为生物被膜，其形成与细菌运动、自聚集和胞外产物分泌等特性有关[20]。本研究中，随着pH升高，拟态弧菌的运动性、自聚集、ECPs分泌和生物膜形成减弱。生物膜形成既可帮助细菌抵抗不利环境，也可协助细菌免疫逃避造成病原的持续感染，病原可经生物膜定殖于宿主后躲避免疫系统识别[21]。研究表明：环境因子如温度、pH和离子强度等影响细菌生物被膜的形成[22]，极端的酸性与碱性环境中形成的生物膜对环境胁迫有更强的抵抗力[23]。本研究中，pH 6.0~8.5时生物膜形成能力随pH升高而减弱，pH 6.0时该能力最强，此时其ECPs分泌量、泳动和自聚集均最强，表明拟态弧菌的感染特性随pH的升高而降低。
代谢是机体产生能量的重要途径，ATP与ADP为其关键底物，且ADP对ATP呈负反馈调节[24]。能量代谢对细菌DNA合成与生长具有重要意义，其代谢中间产物能够调节DNA复制的启动[25]。pH 8.5时，拟态弧菌3-磷酸甘油脱氢酶vm16550和pdhR等参与糖酵解的基因表达显著上调，细菌增殖较快，而参与ADP合成的腺苷酸激酶vm10210和磷酸核糖基甘氨酰胺甲酰基转移酶vm03760等基因表达下调，可能是ADP负反馈调节发挥了作用，但具体原因还需进一步研究。pH 8.5时，拟态弧菌生物膜形成、胞外蛋白酶分泌和ECPs毒力减弱，此时参与多肽翻译的核糖体亚基30S与50S基因以及参与物质跨膜运输的secY和ompW基因表达下调。细菌核糖体亚基30S和50S协作参与多肽链的翻译过程[26]；secY蛋白协助蛋白质穿过内膜参与其分泌过程[27]，外膜蛋白ompW参与疏水性小分子和铁的转运以及细菌对环境的应激调节[28]。pH 8.5时，拟态弧菌感染相关表型、ECPs蛋白质量浓度及其酶活性等特性减弱可能与相关基因表达下调有关。
4. 结论
pH对拟态弧菌感染相关表型及ECPs特性具有明显影响，pH 8.0~8.5条件下其感染与致病相关特性处于较低水平； pH可能是通过调节拟态弧菌能量代谢与膜运输等过程影响相关生物学特性。
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图 1 基于于ITS-5.8S rDNA序列的邻接法(neighbour-joining)系统发育分析
注：节点上标注的是大于50%经1 000 次比对后所得的检验值，以球孢白僵菌Beauveria bassiana为外群。
Figure 1. Phylogenetic tree based on the sequences of ITS-5.8S regions
Note：The bootstrap branch support was regarded conclusive when exceeding 50%. Gene sequences of Beauveria bassiana were used to root the tree
表 1 不同培养基对黄绿绿僵菌产孢的影响
Table 1 Effect of solid medium on the sporulation of M. flavoviride Ma130821
固体培养基
solid medium每克基质产粉量×10/(mg·g−1) yield of conidial powder 每克孢子含孢量×107
number of conidia每克基质产孢数×108
number of conidia per gram substrate孢子含水量/%
water content玉米maize 2.09±0.23 cC 0.51±0.01 bB 0.11±0.01 cBC 1.03±0.01 bB 麦麸wheat bran 35.6±2.86 aA 1.29±0.13 bB 4.78±0.18 bB 32.00±0.04 aA 大米rice 9.6±0.89 bB 16.67±0.95 aA 16.57±2.63 aA 2.00±0.01 bB 稻壳rice husk 0.74±0.10 cC 0.23±0.03 bB 0.02±0.01 cC 1.01±0.01 bB 注：数据为平均数±标准误。数据后的小写字母表示差异达5%显著水平，大写字母表示差异达1%显著水平；下同。
Note: Data are mean±SE. Data followed by different lowercases indicate significant difference at 0.05 level and different capitals indicate significant difference at 0.01 level; the same as below.
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表 2 不同培养基上孢子萌发率比较
Table 2 The comparison of germination rate of spores in different solid medium
固体培养基
solid medium累积萌发率/% cumulative germination rate 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 玉米maize 24.01±0.03 bAB 49.00±0.01 abAB 67.00±0.04 bB 84.00±0.04 bB 96.00±0.03 aA 100.00±0.00 aA 麦麸wheat bran 22.00±0.04 bB 43.00±0.05 bB 59.02±0.02 cBC 76.03±0.03 cBC 89.00±0.03 bB 100.00±0.00 aA 大米rice 36.00±0.04 aA 55.00±0.03 aA 78.03±0.01 aA 99.00±0.00 aA 100.00±0.00 aA 100.00±0.00 aA 稻壳rice husk 22.00±0.03 bB 41.01±0.04 bB 55.00±0.02 cC 74.67±0.01 cC 89.02±0.01 bB 100.00±0.00 aA
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表 3 不同温度对黄绿绿僵菌Ma130821菌株产孢的影响
Table 3 Effects of temperature on the sporulation of M. flavoviride Ma130821
温度/℃
temperature每克基质产粉量×10/(mg·g−1)
yield of conidial powder每克孢子含孢量×109
number of conidia每克基质产孢数×1010
number of conidia per gram substrate孢子含水量/%
water content20 2.50±0.60 aA 0.90±0.11 bAB 2.22±0.57 aA 40.72±0.01 aA 25 1.40±0.10 abA 1.47±0.31 aA 2.15±0.66 aA 1.06±0.01 bB 28 1.40±0.60 abA 0.21±0.06 cC 0.29±0.09 bB 1.11±0.01 bB 30 0.90±0.30 bA 0.49±0.03 bcBC 0.43±0.19 bB 0.72±0.01 bB
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表 4 不同温度下黄绿绿僵菌Ma130821菌株的孢子萌发率
Table 4 The germination rate of conidia of M. flavoviride Ma130821 at different temperatures
温度/℃
temperature不同时间累积萌发率/% cumulative germination rate 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 20 27.07±0.01 bB 52.83±0.01 bB 70.63±0.01 bB 100.00±0.00 aA 100.00±0.00 aA 100.00±0.00 aA 25 36.60±0.02 aA 63.00±0.02 aA 87.00±0.01 aA 100.00±0.00 aA 100.00±0.00 aA 100.00±0.00 aA 28 19.33±0.02 cC 26.67±0.01 dD 48.33±0.02 dD 75.00±0.01 dD 94.00±0.03 bB 99.00±0.01 aA 30 22.33±0.01 cC 37.33±0.01 cC 57.33±0.01 cC 90.00±0.02 cC 98.67±0.01 aAB 98.67±0.01 aA
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表 5 不同光照对黄绿绿僵菌菌株产孢的影响
Table 5 Effects of photoperiod on the sporulation of M. flavoviride strain Ma130821
光周期(L:D)
photoperiod孢子成熟时间
time of spores maturity每克基质产粉
量×10/(mg·g−1) yield of
conidial powder每克孢子含孢量×108 number of conidia 每克基质产孢数×109
number of conidia per
gram substrate孢子含水量/%
water content16:8 3 1.3±0.4 aA 5.07±0.19 aA 6.77±2.19 aA 0.47±0.01 aA 14:10 4 1.4±0.3 aA 0.23±0.01 bB 0.32±0.08 bB 12.37±0.01 bB
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表 6 不同光照条件下生产的孢子的萌发率
Table 6 The germination rate of spores produced under different photoperiods
光周期(L:D)
photoperiod累积萌发率/% cumulative germination rate 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 16:8 46.36±0.03 aA 74.17±0.03 aA 97.20±0.02 aA 100.00±0.0 aA 100.00±0.0 aA 14:10 35.40±0.02 bB 56.67±0.03 bB 77.60±0.02 bB 88.70±0.02 bB 100.00±0.0 aA
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1. 翟玮，孔祥青，陈钊，丁祝进，葛红星，常志强. 循环率对循环水凡纳滨对虾养殖系统水质和细菌群落组成的影响. 江苏海洋大学学报(自然科学版). 2024(04): 1-8 . 
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