连续有机无机配施对植烟土壤归一化酶活性的影响
Effects of Combination of Organic and Inorganic Fertilization on the Normalized Enzyme Activity of Flue-cured Tobacco Soil under Continuing Chemical Fertilizers Reduction
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土壤在农业可持续中扮演重要角色[1]。烤烟是云南农业重要的组成部分，也是云南农村经济的支柱产业，农民过于注重化肥带来的短期生产效益，而忽视种植模式的改进和有机肥料的施用，造成植烟土壤有机质含量缩减，良好团粒结构形成困难，从而限制了烤烟的发展[2-3]。因此，如何提高土壤质量、实现农业可持续是目前急需解决的问题[4]。
土壤酶活性的改变可以指示土壤质量的潜在变化，揭示土壤中进行各种生物化学过程的状态[5]。研究表明：合理施用有机肥可以提高土壤酶活性，如水稻土长期施用有机肥[6]、植烟土壤连年绿肥翻压[7]、棉田化肥减量配施有机肥[8]均能提高土壤酶活性。然而，不同土壤类型、不同作物体系有机无机配施对土壤酶活性的影响、酶活性与土壤养分及土壤微生物量碳的关系研究结论不一[9-11]。因此，相比不同土样单一酶活性评价土壤肥力带来的片面影响，使用总体酶活性更具客观性，且总体酶活性无量纲的最终参数更具说服力，因此选用结合性酶指标——归一化酶活性强度来评价是十分必要的[12]。目前土壤归一化酶活性已作为土壤健康指标应用于红壤性水稻土[13]和湿地水稻土[14]。
已有研究表明：在化肥减量条件下增加有机肥的投入能够提高土壤活性有机碳含量[15-16]，使土壤生物活动活跃[17]，土壤有机碳转化加速[18]，减少烤烟土传病害发生[19] ，修复土壤营养失调，提高土壤肥力[20]。但以往研究报道或仅为田间单次施用的效果，或为盆栽试验[9]，而连续化肥减量配施有机肥对植烟土壤酶活性的影响如何、植烟土壤酶活性与土壤养分和活性有机碳关系如何都有待进一步探讨。
因此，本研究连续4年在化肥减量配施有机肥和生物有机肥定点定位条件下，研究对植烟土壤酶活性的影响，采用归一化酶活性综合探讨酶活性和土壤养分以及活性有机碳的关系，以期为化肥减量和烤烟优质绿色可持续生产提供依据和参考。
1. 材料与方法
1.1 试验区概况
田间小区定位试验2011年开始于云南省文山州麻栗坡县大坪镇凉水井村委会乌龟山(N23°07'，E104°37')，海拔为1 566 m。
1.2 试验材料
1.2.1 供试品种与土壤
供试烤烟品种为K326，表1为2011年供试土壤基本理化性状。
表 1 供试土壤基本理化性状Table 1. The basic physical and chemical properties of the test soilpH 有机质
organic matter速效氮
available N速效磷
available P速效钾
available K5.64 27.9 139.8 49.1 177.6 1.2.2 供试肥料基本情况
供试化肥基肥(含8%N、15%P2O5、22%K2O)和追肥(含15%N、无P2O5、33%K2O)均为烟草专用肥。供试精制有机肥和生物有机肥由江苏新天地生物肥料工程中心有限公司提供。精制有机肥和生物有机肥有机质含量分别在35%和25%及以上，两种有机肥的氮、磷、钾含量都在5%及以上。
1.3 试验设计
试验设计CK、CF、OF和BIO 4个处理：CK为不施肥处理；CF为当地常规施肥(100%NPK化肥)；OF为80%NPK化肥+200 kg/667 m2精制有机肥；BIO为80%NPK化肥+200 kg/667 m2生物有机肥。4个处理3次重复，共计12个小区。每小区5墒，每墒8株，共植烟40株，株行距50 cm×120 cm，小区面积30 m2，采用随机区组排列。
CF处理施肥量按纯氮7 kg/667 m2施入，其中基肥4 kg/667 m2，追肥为3 kg/667 m2，m (N)∶m (P2O5)∶m (K2O)=1∶1∶2.5。配施有机肥的OF和BIO处理的化肥用量与常规施肥相比，氮、磷、钾养分全生育期均减少20%，施肥方式与CF相同，化肥基肥和两种有机肥均在移栽前一次性施入，移栽20 d后追施化肥。试验期间不喷洒农药，并严格按照优质生产技术管理到位。
1.4 土样采集与分析方法
1.4.1 土样的采集
采烤全部结束后多点采集根区土，并采用四分法去除明显的石块和动植物残留物，一部分放入自封袋中，每袋约0.5 kg，立即带回实验室放入4 ℃冰箱中保存，用于测定土壤有机碳和酶活性，另一部分风干以后过0.25 mm和1 mm的筛存留测。采集的土壤为定点定位条件下连续施肥试验第4年的样品。
1.4.2 分析方法
土壤有机质采用重铬酸钾外加热法测定；土壤碱解氮采用碱解扩散法测定；土壤有效磷采用0.5 mol/L NaHCO3法；土壤速效钾采用1 mol/LNH4OAc浸提，火焰光度法；pH值用pH计测定(水土比为2.5∶1)；土壤酶活性测定：脲酶用靛酚蓝比色法；蔗糖酶用3, 5—二硝基水杨酸比色法；碱性磷酸酶用磷酸苯二钠比色法[21] ；土壤微生物量碳的测定采用氯仿熏蒸硫酸钾浸提法，微生物量碳=2.64△EC，式中，△EC表示熏蒸与未熏蒸土壤的浸提液有机碳差值[22]；土壤可溶性有机碳的测定采用0.5 mol/L硫酸钾溶液浸提，溶液过0.45 μm的滤膜，然后用重铬酸钾外加热法测定滤液中有机碳含量[23]；土壤颗粒有机碳的测定采用5 g/L六偏磷酸钠溶液进行分散，溶液过53 μm土壤筛，然后用重铬酸钾外加热法测定残留土壤筛上的土壤有机碳含量[24]。
1.5 数据处理
归一化酶活性值采用多属性决策法对酶活性归一化处理[14, 19]，首先按照以下公式将4个处理中的4种酶活性分别进行归一化，然后将每个处理归一化的4种酶活性值相加求算数平均数，最终得到每个处理的归一化酶活性值。
$ x_i^{'}=\frac{{{x_i}}}{{\sum\nolimits_{i{\text{ = 1}}}^4 {{x_i}\left( {{{i}} = 1,2,3,4} \right)} }} $
(1) 最后将归一化酶活性值与土壤活性有机碳和土壤养分做相关分析。试验数据采用Microsoft Excel 2007软件处理数据，用SPSS 17.0软件进行方差分析(Duncan法)差异显著性水平设为α=0.05。
2. 结果与分析
2.1 化肥减量配施不同有机肥对烤烟经济指标的影响
由图1可知：化肥减量有机替代20%能提高烤烟产量，增加烤烟上等烟比例，并提高产值。其中，与常规施肥相比，化肥减量配施生物有机肥能显著提高上等烟比例和产值，对烟叶产量和中上等烟比例有增加趋势。
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图 1 化肥减量配不同有机肥对烤烟经济指标的影响注：CK. 不施肥处理；CF. 常规施肥(100%化肥)处理；OF. 80%化肥+精制有机肥处理；BIO. 80%化肥+生物有机肥处理；下同。Figure 1. Effect of different fertilizers on the economic indicators of flue-cured tobacco under chemical fertilizer reductionNote: CK. no fertilizer; CF. 100% chemical fertilizer; OF. 80% chemical fertilizer+organic fertilizer; BIO. 80% chemical fertilizer+bio-organic fertilizer；the same as below.与CF处理相比，OF和BIO能提高烤烟的产量，但是无显著差异。OF和BIO的产量相比，BIO比OF提升7.1%，BIO效果更佳。与CF相比，OF和BIO均能提高烤烟的产值，CF与OF无显著差异，而BIO却比CF显著提升32.8%。与CF处理相比，OF处理和BIO处理的烤烟上等烟比例分别显著增加18.46%和58.13%，说明化肥减量配施精制有机肥和配施生物有机肥对增加烤烟上等烟比例有显著作用；OF处理与BIO处理相比，BIO处理显著增加33.48%，说明在提升烤烟上等烟比例方面，化肥减量配施生物有机肥比配施精制有机肥效果更理想。与CF处理相比，OF处理与BIO处理能显著增加烤烟中上等烟比例，但是OF处理和BIO处理间未达到显著差异。
2.2 化肥减量配施不同有机肥对烤烟土壤化学性状的影响
由表2可知：至烤烟采烤结束，较CK相比，CF处理的土壤pH降低了0.25个单位，可以看出如果长时间只施用化肥可能会使土壤pH下降，加剧土壤酸化的可能性。而较CF处理相比，OF处理和BIO处理的土壤pH分别显著升高了0.62个单位和0.58个单位，OF处理和BIO处理间无显著差异，说明化肥减量配施精制有机肥和化肥减量配施生物有机肥都可以有效缓解植烟土壤酸化问题，改良土壤。
表 2 化肥减量配施不同有机肥对植烟土壤化学性状的影响Table 2. Effect of different fertilizers on the chemical properties of flue-cured tobacco soil under chemical fertilizer reduction处理
treatmentpH 有机质/(g·kg−1)
organic matter碱解氮/(mg·kg−1)
available N速效磷/(mg·kg−1)
available P速效钾/(mg·kg−1)
available K可溶性有机碳/(mg·kg−1)
DOCCK 5.45±0.12 ab 22.11±1.00 c 128.05±8.88 b 31.39±4.79 b 402.87±56.96 b 83.93±17.82 b CF 5.20±0.15 b 25.28±1.87 b 160.29±5.53 a 58.57±3.94 a 633.08±56.96 a 100.12±16.61 b OF 5.82±0.20 a 31.59±1.54 a 156.60±4.22 a 53.98±3.54 a 633.08±56.96 a 149.74±9.88 a BIO 5.78±0.29 a 32.73±2.29 a 164.89±8.88 a 61.75±4.90 a 698.85±56.96 a 174.56±17.82 a 注：CK. 不施肥处理；CF. 常规施肥(100%化肥)处理；OF. 80%化肥+精制有机肥处理；BIO. 80%化肥+生物有机肥处理。
Note: CK. no fertilizer; CF.100% chemical fertilizer; OF. 80% chemical fertilizer+organic fertilizer; BIO. 80% chemical fertilizer+bio-organic fertilizer.较CK相比，其他处理都显著提高土壤有机质含量，而OF和BIO比CF更能显著增加土壤有机质含量，OF处理和BIO处理的土壤有机质含量分别显著增加了24.96%和37.38%。从结果来看，BIO处理较OF处理对提升植烟土壤有机质的效果更佳，但BIO处理和OF处理间未达显著差异；并且，化肥减量无论配施精制有机肥还是生物有机肥都能显著提升土壤可溶性有机碳含量，BIO处理和OF处理间未达显著差异。
至烤烟采烤结束，CF、OF和BIO处理的土壤碱解氮、速效磷和速效钾含量均无显著差异，但是OF和BIO处理能有效减缓土壤酸化，丰富土壤中有机质和可溶性有机碳含量，为土壤质量健康发展提供了基本保障。
2.3 化肥减量配施不同有机肥对烤烟土壤酶活性的影响
2.3.1 化肥减量配施不同有机肥对烤烟土壤脲酶活性的影响
如图2所示：较CK相比，CF、OF和BIO的土壤脲酶活性分别显著提高了104.8%、108.1%和108.1%；CF、OF和BIO之间没有显著差异。有机无机配施对提升植烟土壤脲酶活性效果更好。
2.3.2 化肥减量配施不同有机肥对烤烟土壤碱性磷酸酶活性的影响
从图2可知：与CK相比，CF和OF均能显著提高植烟土壤碱性磷酸酶活性。较CF相比，OF提高碱性磷酸酶活性11.11%，但二者之间差异不显著，而BIO与CF相比显著提高了27.78%，说明化肥减量配施生物有机肥比配施精制有机肥对提升碱性磷酸酶效果更显著。研究结果表明：化肥减量有机替代对提升土壤磷酸酶活性有一定效果。
2.3.3 化肥减量配施不同有机肥对烤烟土壤脱氢酶活性的影响
由图2可知：较CF相比，OF和BIO对土壤脱氢酶活性有显著提高作用，增幅分别为35.83%和41.94%，说明有机肥料的配施对提升植烟土壤脱氢酶效果显著。BIO与OF相比，二者之间对提升脱氢酶活性未达显著差异，但BIO比OF提高了4.49%，说明化肥减量配施生物有机肥更有利于脱氢酶活性的提高。
2.3.4 化肥减量配施不同有机肥对烤烟土壤蔗糖酶活性的影响
从图2可见：化肥减量有机替代对土壤蔗糖酶活性的影响趋势与碱性磷酸酶活性相似，较CF相比，OF对提高植烟土壤蔗糖酶活性没有显著差异，BIO与CF相比显著提高了19.23%。可见：在同等减量化肥20%的情况下，配施生物有机肥对提升蔗糖酶活性效果更显著。
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图 2 化肥减量配施不同有机肥对植烟土壤酶活性的影响Figure 2. Effect of different organic fertilizers on the soil enzyme activities of flue-cured tobacco under chemical fertilizers reduction2.3.5 化肥减量配施不同有机肥对烤烟土壤归一化酶活性的影响
不同处理对归一化酶活性的影响如图3所示。与不施肥相比，施肥显著提高植烟土壤的归一化酶活性，归一化酶活性的大小顺序为CK<CF<OF<BIO。与CF相比，OF和BIO对植烟土壤归一化酶活性提升显著，OF与BIO分别显著提高11.88%和19.88%。所以，化肥配施有机肥可显著增强土壤酶活性，比单施化肥效果要好。BIO处理与OF处理相比来看，BIO显著提高7.15%。说明化肥减量配施生物有机肥较精制有机肥对提升植烟土壤酶活性效果较好。
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图 3 化肥减量配施不同有机肥对植烟土壤归一化酶活性的影响Figure 3. Effect of different organic fertilizers on the soil normalized enzyme activity of flue-cured tobacco under chemical fertilizers reduction2.4 植烟土壤酶活性与土壤活性有机碳及养分的相关性分析
表3表明：植烟土壤归一化酶活性与微生物量碳、可溶性有机碳和颗粒有机碳都呈极显著正相关，同时土壤归一化酶活性和土壤速效养分也呈极显著正相关，说明土壤有机碳组分对植烟土壤酶活性的提高具有显著作用，并且，酶活性的提高加速了烤烟对速效养分的吸收利用，促进烤烟增值增产。3种有机碳中颗粒有机碳与归一化酶活性和土壤有效养分的相关性最好，说明虽然颗粒有机碳在土壤中所占的比重小，但是颗粒有机碳对土壤管理变化的响应更为敏感，有机肥的加入对颗粒有机碳颇有影响。pH与土壤归一化酶活性显著正相关，pH与各活性有机碳组分之间呈正相关关系，但相关性不显著。
表 3 植烟土壤归一化酶活性与土壤活性有机碳及养分的相关性分析Table 3. Pearson correlation between the normalized enzyme activity and labile organic carbon and nutrient of flue-cured tobacco soil项目item NEA pH 碱解氮available N 速效磷available P 速效钾available K NEA 1 0.594* 0.877** 0.928** 0.903** MBC 0.886** 0.421 0.709** 0.777** 0.770** DOC 0.835** 0.210 0.679* 0.725** 0.653* POC 0.939** 0.483 0.842** 0.882** 0.868** 注：NEA. 归一化酶活性；MBC. 微生物量碳；DOC. 可溶性有机碳；POC. 颗粒有机碳。“*”表示显著相关(P<0.05)，“**”表示极显著相关(P<0.01)。
Note：NEA. normalized enzyme activity; MBC. microbial biomass carbon; DOC. dissolved organic carbon; POC. particulate organic carbon. “*”means significant at 5% level, “**”means highly significant at 1% level.3. 讨论
3.1 化肥减量配施不同有机肥对烤烟经济性状及养分的影响
本试验研究结果表明：在连续化肥减量20%条件下，化肥减量有机肥替代可以提高烤烟产量，显著优化烤烟品质。目前已有许多研究表明：有机无机肥合理配施可培肥土壤，烟株根系发育良好，从而提高产量并改善品质[25] 。这可能是由于生物有机肥本身富含多种功能性微生物和丰富的微量元素，可以影响原有土壤微生物环境，同时提高了土壤中的酶活性，加速植株对土壤中速效养分的吸收利用，从而提高烤烟产量和品质[16，18]。本研究结果表明：化肥减量配施不同有机肥能显著增加土壤有机质含量和活性有机碳含量，这可能由于有机肥及时补充碳含量进而减少对原有有机质的矿化损失有关[26] 。较CF相比，OF和BIO的土壤pH得到提升，土壤溶液中H+和Al3+的浓度就会有所降低，减少对根系的不良损伤[27]。因此，减少化肥用量，重视有机肥投入能有效缓解植烟土壤酸化，营造良好的土壤环境，对烟株的优良生长具有重要意义。
3.2 化肥减量配施不同有机肥对植烟土壤酶活性的影响
土壤是一个复杂的环境系统，土壤里很大一部分的生物化学反应都需要酶的参与和驱动，所以土壤酶活性的优劣经常被用来作为“土壤肥力”、“土壤质量”和“土壤健康”的代名词[28]。本研究结果表明：单施化肥、化肥减量配施有机肥和生物有机肥均能提高植烟土壤酶活性。脲酶催化尿素、羟基脲和氨基脲等水解，生成植物根系可吸收利用的氨，可用于评价土壤的供氮能力，并且一般需要有机质和矿物质的参与[9]。本研究结果表明：与常规施肥相比，化肥减量有机替代可以一定程度上提高植烟土壤脲酶活性，可能是由于有机肥可以提供丰富的有机氮和有机质含量，土壤酶活性增加，因此有机无机结合施肥技术能有效提高土壤脲酶活性；蔗糖酶与土壤碳素循环密不可分，可表征土壤分解利用有机碳的能力，本研究中，OF和BIO的土壤蔗糖酶活性较CF相比显著提高，其中，BIO又比OF蔗糖酶活性高，这与姜佰文等[11]的有机无机配施研究结果类似。原因可能是有机肥的投入给土壤带入更多的有机碳，需要更多的蔗糖酶来活化土壤养分，所以OF和BIO蔗糖酶活性较CF高。脱氢酶作为氢的中间传递体，在有机物的氧化还原反应中扮演重要角色。在本研究中，较CF相比，施入有机肥的OF和BIO都能提高脱氢酶活性。磷酸酶对于植物营养(特别是磷素)有着重要的意义。根系是酸性磷酸酶的主要生产者，而碱性磷酸酶主要是由细菌、真菌和动物产生，本试验中生物有机肥添加了拮抗微生物[29]，测定碱性磷酸酶更能揭示有机肥对酶活性的影响，本研究结果表明：较OF相比，BIO的土壤碱性磷酸酶活性显著提高。陆海飞等[13]通过长期有机无机配施对红壤性水稻土酶活性的影响研究表明：有机无机配施优于单施化肥，与本研究结果一致。
3.3 植烟土壤酶活性与土壤速效养分和有机碳组分的相关分析
土壤酶在土壤生化进程中起到了无可替代的作用，酶活性的改变能或多或少地影响着土壤健康和植株的生长发育。由此归一化酶活性值的引入能更恰当的反映土壤总体酶活性的情况，结果显示：土壤归一化酶活性值与有机碳组分和速效养分之间呈显著正相关，这与陆海飞等[13]的研究结果一致，这可能是由于有机肥的增施加强了土壤保水保肥的能力，根系生长良好，根系分泌旺盛，同时给微生物创造了舒适的生活环境，促进微生物大量繁殖，土壤酶活性相应提高。酶活性的提高一方面有利于加速土壤氮、磷、钾等养分的转化吸收[30]，另一方面也提高了根际微生物对有机碳源的分解利用。施肥能提高土壤可溶性有机碳含量，有机无机肥料配施效果更好，原因是施用有机肥能有效改善土壤理化环境，有利于土壤有机质降解，并且有机肥的加入降低了根际微生物对原有有机碳的分解，增加了土壤有机碳库容量，加强了土壤碳库的稳定性，提高了土壤肥力。说明有机肥料在改良土壤肥力、增强酶活性和作物提质增效方面有很重要的作用。
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图 1 化肥减量配不同有机肥对烤烟经济指标的影响
注：CK. 不施肥处理；CF. 常规施肥(100%化肥)处理；OF. 80%化肥+精制有机肥处理；BIO. 80%化肥+生物有机肥处理；下同。
Figure 1. Effect of different fertilizers on the economic indicators of flue-cured tobacco under chemical fertilizer reduction
Note: CK. no fertilizer; CF. 100% chemical fertilizer; OF. 80% chemical fertilizer+organic fertilizer; BIO. 80% chemical fertilizer+bio-organic fertilizer；the same as below.
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图 2 化肥减量配施不同有机肥对植烟土壤酶活性的影响
Figure 2. Effect of different organic fertilizers on the soil enzyme activities of flue-cured tobacco under chemical fertilizers reduction
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图 3 化肥减量配施不同有机肥对植烟土壤归一化酶活性的影响
Figure 3. Effect of different organic fertilizers on the soil normalized enzyme activity of flue-cured tobacco under chemical fertilizers reduction
表 1 供试土壤基本理化性状
Table 1 The basic physical and chemical properties of the test soil
pH 有机质
organic matter速效氮
available N速效磷
available P速效钾
available K5.64 27.9 139.8 49.1 177.6 
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表 2 化肥减量配施不同有机肥对植烟土壤化学性状的影响
Table 2 Effect of different fertilizers on the chemical properties of flue-cured tobacco soil under chemical fertilizer reduction
处理
treatmentpH 有机质/(g·kg−1)
organic matter碱解氮/(mg·kg−1)
available N速效磷/(mg·kg−1)
available P速效钾/(mg·kg−1)
available K可溶性有机碳/(mg·kg−1)
DOCCK 5.45±0.12 ab 22.11±1.00 c 128.05±8.88 b 31.39±4.79 b 402.87±56.96 b 83.93±17.82 b CF 5.20±0.15 b 25.28±1.87 b 160.29±5.53 a 58.57±3.94 a 633.08±56.96 a 100.12±16.61 b OF 5.82±0.20 a 31.59±1.54 a 156.60±4.22 a 53.98±3.54 a 633.08±56.96 a 149.74±9.88 a BIO 5.78±0.29 a 32.73±2.29 a 164.89±8.88 a 61.75±4.90 a 698.85±56.96 a 174.56±17.82 a 注：CK. 不施肥处理；CF. 常规施肥(100%化肥)处理；OF. 80%化肥+精制有机肥处理；BIO. 80%化肥+生物有机肥处理。
Note: CK. no fertilizer; CF.100% chemical fertilizer; OF. 80% chemical fertilizer+organic fertilizer; BIO. 80% chemical fertilizer+bio-organic fertilizer.
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表 3 植烟土壤归一化酶活性与土壤活性有机碳及养分的相关性分析
Table 3 Pearson correlation between the normalized enzyme activity and labile organic carbon and nutrient of flue-cured tobacco soil
项目item NEA pH 碱解氮available N 速效磷available P 速效钾available K NEA 1 0.594* 0.877** 0.928** 0.903** MBC 0.886** 0.421 0.709** 0.777** 0.770** DOC 0.835** 0.210 0.679* 0.725** 0.653* POC 0.939** 0.483 0.842** 0.882** 0.868** 注：NEA. 归一化酶活性；MBC. 微生物量碳；DOC. 可溶性有机碳；POC. 颗粒有机碳。“*”表示显著相关(P<0.05)，“**”表示极显著相关(P<0.01)。
Note：NEA. normalized enzyme activity; MBC. microbial biomass carbon; DOC. dissolved organic carbon; POC. particulate organic carbon. “*”means significant at 5% level, “**”means highly significant at 1% level.
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