植物花芽分化是一个复杂的生理生化和形态建成过程，是植物体内各因子共同作用、相互协调的结果，并受外界环境的影响，在此期间，不仅养分、水分等不断地运往花芽，而且内源激素和光合产物也持续地供给花的发育^[1]。鳞茎类植物由于其特殊的形态结构，其在生理特性、养分运输等方面均有一定的特异性，有关鳞茎类球根花卉花芽分化机制的研究中，百合^[2]、石蒜^[3]和鸢尾^[4]等植物较为深入，有关番红花花芽分化过程中内源激素和糖含量变化的研究尚未见报道。

番红花(Crocus sativus L.)属鸢尾科番红花属多年生三倍体鳞茎类球根花卉，是一种重要的资源植物，素有“植物黄金”之称^[5]。近年来，因其巨大的药用开发潜力和较高的园林观赏价值，已成为药学界和园艺学界研究的热点。番红花原产伊朗、小亚细亚半岛和希腊等地^[6]，引种后采用“二段式”栽培模式，即当年11月下旬室内开花后移至大田种植，越冬生长并繁殖出子代球茎，翌年5月上旬进入休眠，采收球茎后转入室内上架栽培，6月底至7月中旬为同化叶分化期，7月底花芽分化开始至9月下旬雌雄蕊分化结束，10月下旬花器官形成，11月上中旬为盛花期。随着中国大面积引种推广，出现了花序小花数量少，种球退化，病害频发和花期短等现象，严重影响产量。本研究首次在里下河平原水网地区引种番红花，以番红花顶芽(花芽)作为研究对象，对番红花花芽分化过程中内源激素和糖含量的动态变化进行研究，旨在了解番红花花芽分化过程中的激素调控和糖代谢变化规律，探讨花芽分化与内源激素水平和糖含量的关系，为今后花期化学调控提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

供试材料为2014年引种到泰州的1年生西班牙番红花组培种球。

1.2   番红花花芽分化时期的确定

根据张衡锋等^[7]的观察，依据花芽分化各时期不同的形态特征，可将整个分化过程分为6个关键阶段(图1a~f)：营养生长期(VP)、花序原基和小花原基分化期(FP)、雄蕊原基分化期(SP)、雌蕊原基分化期(PP)、花芽发育期(DP)和盛花期(MP)，可确定在7月10日—11月15日试验期间，7月底是番红花由营养生长向生殖生长转变的转折点，花器官按照萼片—外轮花被—雄蕊—内轮花被—雌蕊的顺序分化，番红花从花芽分化开始到花器官功能形成共经历65 d左右。

图  1  番红花花芽分化过程和球茎取样示意图

注：a) 营养生长期；b) 花序原基和小花原基分化期；c) 雄蕊分化期；d) 雌蕊分化期；e) 花芽发育期；f)开花；g) 无鳞片球茎；h) 球茎横切面；图中方框为花芽取样区。

Figure  1.  Process of flower bud differentiation and sampling schematic in C. sativus

Note: a) vegetative growth period (VP); b) inflorescence primordia and floral primordia differential period (FP); c) stamen differential period (SP); d) pistil differential period (PP); e) flower bud developmental period (DP); f) flowering period (MP); g) corm without scale; h) corm transection; pane mark sampling area.

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1.3   材料处理

本试验在江苏农牧科技职业学院药用植物生理生化实验室进行。2014年7月10日挑选500枚生长完好、质量为(25±1) g的种球置于温度25 ℃、湿度75 %、光照0 lx的培养箱中培养，模拟室内育花环境，根据番红花常规栽培方法，当花芽长至7 cm时，光照每7 d增加300 lx，最强光照值1 200 lx，直至花朵全部开放。在番红花花芽分化的6个关键阶段分别取样，分别挑选15枚正常的球茎，剥去鳞片，洗净、吸干，对顶芽(花芽)进行取样、称量(图1g~h)，重复3次，将称好的样品立即液氮冷冻处理，并于冰箱中−76 ℃超低温保存、备试。

1.4   测定方法

1.4.1   碳水化合物含量的测定

可溶性糖含量和淀粉含量参照张志良等^[8]的方法，采用蒽酮比色法测定；淀粉酶活性参照王学奎^[9]的方法，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定。

1.4.2   内源激素含量的测定

内源激素含量的测定参照赫冬梅等^[10]的间接酶联免疫吸附法(ELISA)，略做调整。取预先称定并保存的样品0.5 g，3 mL 80%甲醇(分3次加入)研磨成匀浆，−4 ℃条件下10 000 r/min下冰冻离心15 min，取上清液。取上清液过Sep-Pak C₁₈预处理小柱(100%甲醇洗柱→70%甲醇平衡→上样→100%甲醇洗柱→100%乙醚洗柱→70%甲醇平衡→上样)纯化2次，过柱后的样品于45 ℃水浴下氮气吹干，稀释液定容、混匀待测。试剂盒由中国农业大学提供，每处理3次重复。测定的植物内源激素有IAA、GA₃、ABA和ZRs。

1.5   数据分析

采用Excel 2013进行数据处理和制表，并用DPS 15.10软件进行统计分析和显著性检验(LSD法)。

2.   结果与分析

2.1   花芽分化过程中内源激素含量的变化

由图2可知：番红花花芽在分化前内源激素在顶芽(花芽)中已有一定的积累，花芽中IAA含量最低值出现在FP，最大值出现在PP，呈现出“降-升-降”的变化趋势，说明低水平的IAA有利于番红花花芽从营养生长向生殖生长转换，高水平IAA有利于番红花花芽的形态分化，尤其是雌蕊的形态分化；花芽中GA₃和GA₄含量的最低值均也出现在FP，与IAA相似，但最大值出现在SP和MP，呈现出“降-升-降-升”的变化趋势，说明低水平的GAs亦有利于番红花花芽向生殖生长转换，高水平的GAs有利于雄蕊分化和花芽生长发育；花芽中ABA最大值出现在FP，之后便不断下降，PP达到最低值，且低于VP，说明高水平ABA有利于番红花花芽向生殖生长转换，形态分化开始后，低水平ABA有利于各器官的分化和发育；与ABA相似，花芽中ZRs亦呈现出“升-降-升”的变化趋势，最大值亦出现在FP，但整过分化过程中，花芽中ZRs水平均高于VP，说明高水平ZRs有利于番红花花芽分化和发育。

图  2  花芽分化过程中IAA、GAs、ABA和ZRs含量的变化

注：图中数据为同一处理3次重复的平均值±标准差。不同大写字母表示组间存在极显著差异(P<0.01)；小写字母表示组间存在显著差异(P<0.05)；下同。

Figure  2.  The variation of IAA, GAs, ABA and ZRs contents during flower bud differentiation

Note: Value represent the means ± SD of three replicates value. Uppercases express extremely significant differences among groups (P<0.01), lowercases express significant differences among groups; the same as below (P<0.05).

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2.2   花芽分化过程中内源激素的平衡

图  3  花芽分化过程中激素比例的变化

Figure  3.  Changes in ratios of endogenous hormones during flower bud differentiation

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由图3可知：ABA/GAs、ABA/IAA和ZRs/GAs在FP均出现1个峰值，比值达到最大值，随后下降，低于或接近VP水平。而ZRs/IAA、GA₃/IAA、ZRs/ABA的比值在番红花花芽分化过程中基本保持稳定，说明高比值的ABA/GAs、ABA/IAA和ZRs/GAs有利于番红花从营养生长向生殖生长转换，与番红花花芽分化及成花密切相关。

2.3   花芽分化过程中糖代谢的变化

如图4所示：番红花花芽分化过程中，可溶性糖含量呈现单峰曲线变化趋势，在PP达到最大值98.5 mg/g (DW)，而淀粉含量则呈现单谷曲线变化趋势，在DP达到最低值70.9 mg/g (DW)，随后急剧上升。另外，α-淀粉酶和β-淀粉酶活性均呈现急剧上升的变化趋势，且均在DP达到最大值，分别为13.61 mg/(g·min)和6.59 mg/(g·min)，说明糖类是番红花花芽分化及发育的能量基础，高水平可溶性糖促进番红花花芽的分化和成花。另外，茎尖中存储了大量的淀粉，花芽分化开始后，淀粉不断被水解成低聚糖(淀粉含量与两种淀粉酶活性均呈显著负相关，r_α=−0.812^*，r_β=−0.904^*)，为花芽分化及发育提供能量，而且在此过程中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性存在较高的同步性，两者极显著正相关，r=0.936^**。

图  4  花芽分化过程中糖含量和淀粉酶活性的变化

注：可溶性糖和淀粉含量的测定采用干样。

Figure  4.  The variation of carbohydrate contents and activity of amylase during flower bud differentiation

Note: The soluble content and starch content determination use dry sample.

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3.   讨论

3.1   内源激素含量变化与花芽分化的关系

植物内源激素是植物花芽分化的关键诱导因子之一，对花芽分化的启动具有重要的调控作用。IAA与植物成花的关系一直存在分歧，主流观点认为低水平IAA有利于植物花芽分化的启动，属于抑花激素^[11]，但也有学者研究发现高水平IAA有利于花芽的分化^[12]，所以到底是促进还是抑制可能与植物种类有关，本研究发现，对番红花而言，IAA是一种抑花激素，但高水平IAA有利于花芽形态的膨大和细胞的增殖。同样，GAs对植物成花调控作用的观点也不一致^[13-14]，同样可能因植物种类而异，对番红花而言，GAs同样属于抑花激素，这与陈鸿等^[2]的研究结果基本一致。在植物成花过程中，ABA可能从两个方面调控：(1)与GA拮抗，促进CTK和营养在花芽中积累，促进成花。(2)诱导花芽休眠，抑制成花。大量研究证实了这两种机制^[15]，ABA在番红花花芽分化过程中的变化，与王磊等^[3]的研究结果相似，高水平的ABA有利于花芽向生殖生长转换，低水平ABA有利于各花器官的形态分化和发育，避免休眠的诱导。高水平的ZRs有利于番红花花芽的分化，属于促花激素，在德国鸢尾和神马切花秋菊花芽分化的研究中有相似的研究结果^{[4, 16]}，另外，植物内源CTK一般产生于根系，但中国番红花多采用“二段式”栽培模式，成花过程中没有根系，所以番红花极有可能通过调控花芽和球茎中CTK比例，提高花芽中CTK含量，保证番红花花芽分化的顺利进行，其调控机制还需进一步深入研究。

3.2   内源激素平衡与花芽分化的关系

大量研究表明：植物成花是各种激素共同调控的结果，各种植物内源激素之间存在相互促进或相互拮抗的生理效应，在动态的变化和平衡中对植物成花起着至关重要的作用。1974年LUCKWILL提出了植物激素平衡调控花芽孕育的假说，激素的平衡能够解除成花基因的阻遏^[17]。本研究中高比例的ABA/GAs、ZRs/GAs和ABA/IAA有利于番红花花芽从营养生长向生殖生长转换，一定程度上支持了LUCKWILL的植物激素平衡假说。

3.3   糖代谢与花芽分化的关系

1983年SACHS等提出营养分配学说，在成花诱导条件下，各种环境因子(如激素)通过改变植物体内营养库—源关系，使茎尖获得比非诱导条件下更多的同化物供应。CASPAR等^[18]研究发现：碳水化合物很可能是成花转变的原因，而不是结果。番红花花芽分化过程中，可溶性糖含量与淀粉含量显著负相关(r=−0.813^*)，淀粉在淀粉酶的水解作用下分解成低聚糖，维持茎尖中的高糖水平来促进花芽分化，这与张荻等^[19]的研究结果相似。由于番红花采用“二段式”栽培模式，在MP前尚未形成功能叶，叶片“源”的作用没有形成，花芽分化所需营养极有可能来源于球茎，这可从侧面解释8 g以下球茎不能开花的原因，自DP到MP，功能叶片(源)逐渐形成，所以茎尖中淀粉含量上升，淀粉酶活性下降。至于茎尖和球茎之间的营养调控机制和传输途径需要进一步深入研究。

4.   结论

综上所述，可以初步推断在番红花花芽分化过程中，花芽分化的诱导需要高水平的ABA和ZRs，低水平的IAA和GA₃，高水平IAA、ZRs、GA₃和低水平ABA促进番红花花芽后期分化和细胞增殖；结合激素平衡学说，高比值的ABA/GA₃、ZRs/GA₃和ABA/IAA有利于番红花花芽从营养生长向生殖生长转换；高水平的可溶性糖含量和淀粉酶活性促进番红花花芽的分化和成花，培育高碳水化合物仔球将是室外繁育种球的主要目标之一。但是单靠番红花花芽分化过程中激素水平的变化和激素间的比值关系尚不能确定哪种激素调控了番红花的成花，还需要后期进行外源激素调控试验进一步证实。