魔芋(Amorphaphallus)为天南星科魔芋属多年生草本植物，主要产于东半球热带、亚热带地区，在中国栽培和食用历史悠久，云南是原产地之一^[1]。随着魔芋种植面积的不断扩大，魔芋病害日趋严重，2014年首次报道了魔芋疫病发生与危害范围逐步扩大^[2-3]。该病的病原菌为烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)，其侵入寄主植物后在很短的时间内产生大量的孢子囊并释放游动孢子，在侵染部位形成水渍状褐色病斑，随后病斑不断扩展，严重时整个植株枯萎死亡^[3-4]。目前大量研究表明：烟草疫霉多存活于土壤中，潜育期短，传播速度快，侵染力强，对植物破坏性大^[5-6]。但对于烟草疫霉菌对魔芋的致病性研究鲜有报道。为明确魔芋疫病烟草疫霉菌的致病性，本研究在温室和实验室条件下，利用植物离体和活体接种法进行致病性鉴定，研究结果将为魔芋轮作种植和病害防治提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

1.1.1   供试品种

田间和温室试验所用魔芋品种均为云南省富源县魔芋研究所提供的富源花魔芋。

1.1.2   供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡糖糖20 g，琼脂15 g，用蒸馏水定容到1 000 mL。V8培养基：V8果汁200 g，碳酸钙3 g，琼脂15 g，用蒸馏水定容到1 000 mL^[7]。水琼脂培养基：2 g琼脂溶于1 L水中。

1.2   试验方法

1.2.1   疫霉菌的分离及纯化

采集病株用清水反复冲洗，75%的酒精表面消毒，无菌水冲洗，用切块培养法取病健交界处置于PDA培养基上，28 ℃培养7 d。用水琼脂培养基进行单孢分离。

1.2.2   温室盆栽接种试验

将分离鉴定的5株烟草疫霉菌(Ps1，Ps2，Ps3，Ps4和Ps5)分别接种到胡萝卜液体培养基中，150 r/min摇床28 ℃振荡培养48 h待用。试验在温室条件下用针刺法对茎基部进行针刺接种，接种密度为1×10⁵ cfu/mL，用无菌水针刺作为对照，接菌后的植株在温室条件下进行培养，每天观察植株的发病情况。

1.2.3   致病性鉴定方法

研究在实验室条件下将疫霉菌Ps1接种到魔芋球茎、茎秆、叶片和根部，以无菌水为空白对照。

(1)根部接种：将魔芋种球洗净表面消毒，将其放入10% NaClO中消毒0.5 min，再用75%酒精消毒1 min，后用无菌水中冲洗2次，将种球放在无菌滤纸上25 ℃保湿培养至生根，再把培养好的菌饼接种到根表面，25 ℃ 保湿培养，观察发病情况。(2)茎基部接种：用灭菌牙签蘸取10⁸ cfu/mL孢子悬浮液接种到健康魔芋植株茎基部，对照用清水注射，每隔2 d观察发病情况。(3)球茎接种：将健康的球茎用95%的酒精表面消毒，接种前用消毒的挑针将各球茎块刺成微伤口，然后接上菌悬液。(4)叶片接种：采集新鲜魔芋叶片，表面消毒后进行伤口接种，28 ℃保湿培养，每隔24 h观察发病情况。研究均设2次重复试验。

发病级别参照大豆疫病划分标准^[8]。0级：无病斑；1级：有零星病斑，但不连片；2级：病斑扩大，但小于表面积的1/4；3级：病斑大于表面积1/4，但小于1/2，菌丝大量繁殖；4级：病斑大于表面积的1/2，但小于3/4，菌丝长满表面，颜色加深；5 级：整体腐烂，颜色变为深褐色。

发病率=发病株数/调查总株数×100%；

病情指数=Σ(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×5)×100。

1.2.4   烟草疫霉对其他寄主致病性测定方法

试验选用马铃薯、辣椒、烟草和大豆4种供试植物进行致病性鉴定，将病原菌接种到供试植物体上。(1)辣椒采用果实伤口接种，分别在红辣椒和青辣椒的果实上接种魔芋疫霉菌块，对照接种未接菌的PDA培养基，28 ℃保湿培养，48 h后观察记录发病情况。(2)马铃薯接种叶片，采用菌悬液接种，在马铃薯叶片上喷洒10⁶ cfu/mL的魔芋疫霉菌悬液，对照喷洒等量的无菌水，28 ℃保湿培养，48 h观察记录发病情况。(3)大豆和烟草均采用茎基部伤口接种，将烟草疫霉菌块切5 mm的小块，用灭菌的脱脂棉包裹在伤口处，用无菌水保湿，对照用未接菌的PDA培养基处理，温室培养，48 h后观察记录发病情况。观察病原菌的侵染情况，调查各处理植株病情指数，评价其致病力强弱。发病级别根据病斑大小以0~5级的标准划分^[9]。

1.3   统计方法

数据采用SPSS 13.0、DPS和Excel进行统计分析，对各处理间的差异性进行方差分析。

2.   结果与分析

2.1   致病性温室试验

将5株烟草疫霉菌菌株接种到魔芋苗茎基部，4 d后伤口周围均开始出现病斑并逐渐向外扩展，6 d后植株茎基部开始腐烂，叶片呈绿色，植株倒伏死亡，发病率达到100%，该症状与田间症状一致(图1)；而对照组仅针刺处有黄白色愈合伤疤，发病率为零。选取发病部位再分离，所得菌株培养性状与接种菌株相同。由此可知烟草疫霉菌对魔芋均表现强致病性，且5株疫霉菌致病性表现一致，因此选取Ps1菌株进行致病性研究。

图  1  由烟草疫霉引起的盆栽魔芋病症

Figure  1.  The potting symptoms on konjac disease caused by P. nicotianae

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2.2   离体接种试验

由表1可知：所有接种部位(魔芋球茎、茎秆、叶片和根部)均表现发病症状，发病率达到100%；对照无症状出现。其中，叶片伤口接种2 d后出现软腐症状，腐烂面积最大可达到叶片的80%，病情指数为98.33；根部接种2 d后开始出现褐色病斑，后褐色病斑逐渐扩大，4 d腐烂坏死，病情指数为94.07。由此可见，烟草疫霉菌对魔芋不同部位都表现出较强致病性，其中烟草疫霉菌对叶片和根部致病力显著高于种球和茎秆(图2)。

表  1  烟草疫霉对魔芋的致病性

Table  1.  The pathogenicity of P. nicotianae strain on konjac

接种部位 inoculation parts	发病率/% disease incidence	发病等级 disease severity	病情指数 disease index
球茎bulb	100	3.92±0.25 b	78.33±5.07 b
茎秆stem	100	3.56±0.06 b	71.11±1.11 b
叶片leaf	100	4.92±0.08 a	98.33±1.67 a
根部root	100	4.71±0.04 a	94.07±0.74 a
对照CK	0	0 d	0 d
注：不同字母表示两者在P=0.05 (LSD)水平差异显著；下同。 　 　 Note: Different letters within a column mean significant difference at P=0.05 (LSD); the same as below.

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图  2  烟草疫霉菌对魔芋的致病性

注：a) 接种烟草疫霉；b) 对照。

Figure  2.  The pathogenicity ofP. nicotianae strain on konjac

Note: a) the treatment inoculated by P. nicotianae; b) CK.

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2.3   烟草疫霉菌对其他寄主的致病性

将烟草疫霉人工接种到辣椒果实、马铃薯叶片、大豆和烟草茎基部，结果表明：Ps1菌株对不同寄主的致病性差异显著。其中，疫霉菌对马铃薯叶片致病性最高，孢子悬浮液接种2 d后叶片变成灰褐色，卷缩；辣椒的病情指数次之，疫霉菌可在辣椒表面形成白色的菌丝，果实呈水浸状，最后腐烂；在烟草的茎基部伤口接种疫霉菌，4 d后接种部位出现黑褐色病斑，随后病斑向上扩展；烟草疫霉菌对大豆致病性最弱，可引起大豆茎基部出现褐色病斑(表2、图3)。从以上发病寄主的病斑处进行病原菌再分离，经形态学鉴定，与接种的烟草疫霉一致，因此确定该烟草疫霉可以侵染辣椒、马铃薯、烟草和大豆。

表  2  烟草疫霉菌对不同寄主的致病性

Table  2.  Pathogenicity of Phytophthora spp. on different plant

植物种类 plant species	发病率/% disease incidence	发病等级 disease severity	病情指数 disease index
辣椒pepper	100	2.75±0.14 ab	55±2.87 ab
马铃薯potato	80	3.03±0.09 a	60.67±1.76 a
大豆soybean	77.78	1.63±0.04 c	32.59±0.74 c
烟草tobacco	100	2.33±0.33 b	46.67±6.67 b

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图  3  不同寄主接种后的症状

注：a) 接种烟草疫霉菌后的辣椒，上为对照组，下为试验组；b) 接种烟草疫霉菌后的马铃薯叶片，上为试验组，下为对照组；c)和d) 接种烟草疫霉菌后的烟草茎部，c) 是试验组，d) 是对照组；e)和f) 接种烟草疫霉菌后的大豆茎部。

Figure  3.  The symptoms of vaccination in different hosts

Note: a) Pepper was inoculated by Phytophthora spp., the up is CK and the down is treatment; b) Potato leaves were inoculated by Phytophthora spp., the up is treatment and the down is CK; c) and d) Tobacco stem was inoculated by Phytophthora spp., c) is treatment and d) is CK; e) and f) Soybean stems were inoculated by Phytophthora spp..

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3.   讨论

疫霉菌是一类重要的植物病原菌，对寄主危害较大。疫霉菌多数为害植物的根或近地面的茎，有的也侵染地上部分，如叶、花和果实，引起根腐、茎腐、果腐、溃疡、萎蔫和斑点等症状，传播速度快，可导致多种植物绝产或灭亡^[10-11]。本研究通过离体和温室试验发现：从魔芋上分离得到的烟草疫霉对魔芋有较强的致病性，可以侵染魔芋的不同部位如根、种球、茎和叶，其中对叶片和根部致病力显著高于种球和茎秆，这与已有研究结果^[3]一致。

烟草疫霉菌的地理分布及寄主范围均很广，其寄主有上万种植物，包括农作物、果树、林木、观赏植物、草本植物和灌木等^[12-14]。烟草疫霉对烟草不存在绝对的寄主专化性，在一定条件下，可以浸染烟草以外的其他寄主，而来自非烟草寄主的烟草疫霉菌株也可以侵染烟草^{[5, 15-18]}。在自然条件下，烟草疫霉菌可侵染草莓^[15]，烟草疫霉还可能使茄子、番茄等致病^[16]；此外，烟草疫霉菌在人工接种条件下还可侵染苹果、番茄等的果实及棉铃、巴婆的茎、番茄幼苗，且是高度致病^[19]。龚龙英等^[18]研究表明：分离自不同寄主的烟草疫霉菌株可使番茄、茄子、烟草等作物致病，且病原菌在一定条件下可交互侵染。本研究从魔芋上分离得到的烟草疫霉菌对马铃薯、辣椒、大豆和烟草均有不同程度的致病性，这与已有的报道一致。烟草疫霉菌可通过土壤、植物病残体、厚垣孢子和卵孢子传播，易造成毁灭性的危害，因此，生产上应将魔芋与其他会交互侵染的作物隔离，避免轮作或间作，以降低病害的发生。