铜锌复合胁迫对菜薹种子萌发、幼苗生长及子叶生理代谢的影响
Effects of Combined Copper and Zinc Stress on the Seed Germination, Seedling Growth and Cotyledon Physiological Metabolism of Chinese Flowering Cabbage
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滇姜花(Hedychium yunnanense)为姜科(Zingiberaceae)姜花属(Hedychium)植物,主要分布于中国的云南省、四川省、广西壮族自治区[1],植物化学研究显示该植物主要包含二萜[2-5]、倍半萜[6-7]等成分,其中部分二萜化学成分显示细胞毒活性和抑制巨噬细胞中NO产生的活性,如本课题组在前期研究中发现滇姜花中二萜化合物hedychenoids B、hedychenone、villosin对肿瘤细胞SGC-7901的生长有抑制作用,化合物hedychenoids B、villosin对巨噬细胞中NO的产生有抑制作用[5]。近年来,作者揭示了多种姜科植物的化学成分及其活性[8-11],为了继续进行该方面的研究,本研究对滇姜花根部的次生代谢产物进行了分离和鉴定,其研究结果将对滇姜花的合理开发和利用提供一定的数据支持。
1. 材料与方法
1.1 仪器与材料
试验样品于2013年采于云南省西双版纳州勐腊县,由中国科学院西双版纳热带植物园谭运红副研究员鉴定为滇姜花(H. yunnanense)。
质谱用API Qstar Pulsar型质谱仪测定;核磁共振谱用Bruker AM-400核磁共振仪测定,TMS为内标;HPLC为Agilent 1260液相色谱仪;薄层层析板和色谱硅胶由青岛海洋化工厂生产;MCI为日本三菱公司生产;TLC检测通过10%硫酸-乙醇溶液加热观察点样斑点。
1.2 提取与分离
干燥的滇姜花根5.0 kg,粉碎后用乙醇热提3次,减压蒸馏,得浸膏323 g;将浸膏分散于蒸馏水中,分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取,回收溶剂,得乙酸乙酯部分170 g;用石油醚-丙酮(9∶1-1∶1)对乙酸乙酯部分进行硅胶柱色谱分离,梯度洗脱,得到6个部分(F1-F6);对F3 (8 g)进行硅胶柱色谱[氯仿-丙酮(20∶1)]分离,得到4个部分F3.1-3.4,其中F3. 4再经硅胶柱色谱[石油醚-乙酸乙酯(8∶2)、氯仿-乙酸乙酯(9∶1)]分离,得到化合物1 (2 mg)、2 (2 mg)、3 (3 mg);对F4 (13 g) 进行硅胶柱色谱[氯仿-乙酸乙酯(10∶1)]分离,得到5个部分F4.1-4.5,其中F4.2经硅胶柱色谱[石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、石油醚-丙酮(3∶1)]分离,再经MCI纯化,得到化合物4 (3 mg)、5 (3 mg)、6 (4 mg)。化合物1~6结构如图1所示。
2. 结果与分析
化合物1:黄色粉末状固体。ESI-MS m/z: 329 [M+1]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 12.66 (1H, s, 5-OH), 8.07 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2′, 6′), 7.02 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.44 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.35 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-6), 3.90 (3H, s, 3-OCH3), 3.87 (3H, s, 7-OCH3), 3.86 (3H, s, 4′-OCH3); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 178.8 (s, C-4), 165.4 (s, C-7), 162.0 (s, C-5), 161.6 (s, C-4′), 156.7 (s, C-9), 155.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-3), 130.1 (d, C-2′, C-6′), 122.8 (s, C-1′), 114.0 (d, C-3′, C-5′), 106.0 (s, C-10), 97.8 (d, C-6), 92.1 (d, C-8), 60.1 (q, 3- OCH3), 55.8 (q, 7- OCH3), 55.4 (q, 4′- OCH3)。以上数据与文献[12]报道的基本一致,故鉴定化合物1为5-羟基-3,7,4′-三甲氧基黄酮(5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone)。
化合物2:黄色粉末状固体。ESI-MS m/z: 343 [M+1]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.94 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.88 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.34 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.18 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 3.98 (3H, s, -OCH3), 3.82 (3H, s, -OCH3), 3.77 (6H, s, -OCH3); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.6 (s, C-4), 163.4 (s, C-7), 160.7 (s, C-5), 160.4 (s, C-4′), 158.5 (s, C-9), 152.2 (s, C-2), 140.6 (s, C-3), 129.3 (d, C-2′, C-6′), 122.7 (s, C-1′), 113.5 (d, C-3′, C-5′), 109.0 (s, C-10), 95.3 (d, C-6), 92.0 (d, C-8), 59.4 (q, -OCH3), 56.0 (q, -OCH3), 55.4 (q, -OCH3), 55.0(q, -OCH3)。以上数据与文献[12]报道的基本一致,故鉴定化合物2为3,5,7,4′-四甲氧基黄酮(3,5,7,4′-tetramethoxyflavone)。
化合物3:黄色粉末状固体。ESI-MS m/z: 343 [M+1]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.82 (2H, d, J = 9.2 Hz, H-2′, 6′), 7.01 (2H, d, J = 9.2 Hz, H-3′, 5′), 6.81 (1H, s, H-5), 6.60 (1H, s, H-3), 3.98 (3H, s, 8-OCH3), 3.97 (3H, s, 6-OCH3), 3.93 (3H, s, 7-OCH3), 3.89 (3H, s, 4′-OCH3); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 177.1 (s, C-4), 162.0 (s, C-4′), 161.2 (s, C-2), 157.5 (s, C-6), 154.6 (s, C-9), 152.5 (s, C-8), 140.4 (s, C-7), 127.8 (d, C-2′, 6′), 123.8 (s, C-1′), 114.5 (d, C-3′, 5′); 112.7 (s, C-10), 107.0 (d, C-3), 96.3 (s, C-5), 62.1 (q, 8-OCH3), 61.5 (q, 7-OCH3), 56.2 (q, 6-OCH3), 55.4 (4′-OCH3)。以上数据与文献[13]报道的基本一致,故鉴定化合物3为6, 7, 8, 4′-四甲氧基黄酮(6,7,8,4′-tetramethoxyflavone)。
化合物4:无色晶体。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.95 (3H, s, -OCH3), 7.03 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.37-7.40 (2H, m), 9.82 (1H, s, -CHO); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 191.0 (d, -CHO), 151.7 (s, C-4), 147.1 (s, C-3), 129.8 (s, C-1), 127.6 (d, C-6), 114.4 (d, C-5), 108.7 (d, C-2), 56.1 (q, 3-OCH3); EIMS m/z: 152 (M+, 60), 151 (72), 81 (100)。以上数据与文献[14]报道的基本一致,故鉴定化合物4为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)。
化合物5:白色晶体。ESI-MS m/z: 155 [M+1]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 6.70 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5), 6.46 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-2), 6.34 (dd, 1H, J = 8.8, 2.4 Hz, H-6), 3.79 (3H, s, -OCH3), 3.76 (3H, s, -OCH3);13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 150.3 (s, C-1), 149.8 (s, C-3), 142.9 (s, C-4), 112.5 (d, C-5), 105.9 (d, C-6), 100.6 (d, C-1), 56.6 (q, -OCH3), 55.7 (q, -OCH3)。以上数据与文献[15]报道的基本一致,故鉴定化合物5为3,4-二甲氧基苯酚(3,4-dimethoxyphenol)。
化合物6:无色晶体。ESI-MS m/z: 209 [M+1]+。1H NMR (Acetone-d6) δ 8.27 (1H, s, OH), 7.69 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-7), 7.42 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2), 7.24 (1H, dd, J = 1.8 和 8.2 Hz, H-6), 6.97 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5), 6.49 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-8), 4.01 (3H, s, 9-OCH3), 3.82 (3H, s, -OCH3); 13C NMR (Acetone-d6) δ 167.1 (C-9), 149.3 (C-3), 147.9 (C-4), 144.9 (C-7), 126.6 (C-1), 123.1 (C-6), 115.3 (C-8), 114.7 (C-5), 110.5 (C-2), 55.5 (-OCH3), 50.7 (9-OCH3)。以上数据与文献[16]报道的基本一致,故鉴定化合物6为methyl ferulate。
3. 讨论
本研究从滇姜花根部中分得6个酚性化合物,经波谱分析和文献报道数据对照,鉴定所分离的6个化合物的结构分别为5-羟基-3,7,4′-三甲氧基黄酮(1)、3,5,7,4′-四甲氧基黄酮(2)、6,7,8,4′-四甲氧基黄酮(3)、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(4)、3,4-二甲氧基苯酚(5)、methyl ferulate (6)。其中化合物1~3为黄酮类化合物,以上化合物均为首次从该植物中分离得到。赵庆等[3, 13]发现滇姜花中多个二萜具有细胞毒活性,并且对滇姜花粗提物、滇姜花素A、姜花酮进行了动物体内抗肿瘤活性测试,结果表明它们均能显著性抑制小鼠体内移植性肿瘤H22的生长,其中滇姜花素A对小鼠H22肿瘤生长抑制率达54.27%,作用最强;李玉鹏等[5]发现滇姜花中部分二萜对NO产生有抑制作用。但是还没有文献报道该植物中酚性成分的分离和药理作用,本课题组将以上述物质为基础,进一步开展相关活性研究,为其合理开发提供依据。
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图 1 铜锌复合胁迫对菜薹子叶相对电导率的影响
注:小写字母为方差分析LSD法0.05水平上差异,大写字母为方差分析LSD法0.01水平上差异;下同。
Figure 1. Effects of combined copper and zinc stress on therelative conductivity in cotyledon of Chinese flowering cabbage
Note: Small and capital letters mean significant difference at 0.05 and 0.01 levels by LSD method, respectively; the same as below.
表 1 不同浓度铜锌复合胁迫
Table 1 Combined stress of copper and zinc at different concentrations
处理 treatment 铜锌胁迫 stress of copper and zinc T1 (CK) 0 mmol/L Cu2+ + 0 mmol/L Zn2+ T2 0.20 mmol/L Cu2+ + 0.17 mmol/L Zn2+; T3 0.40 mmol/L Cu2+ + 0.34 mmol/L Zn2+; T4 0.80 mmol/L Cu2+ + 0.68 mmol/L Zn2+ T5 1.20 mmol/L Cu2+ + 1.02 mmol/L Zn2+ T6 1.60 mmol/L Cu2+ + 1.36 mmol/L Zn2+ T7 2.00 mmol/L Cu2+ + 1.70 mmol/L Zn2+ T8 2.40 mmol/L Cu2+ + 2.04 mmol/L Zn2+ 表 2 铜锌复合胁迫对菜薹种子萌发的影响
Table 2 Effects of combined copper and zinc stress on the seed germination of Chinese flowering cabbage
处理
treatment发芽势/%
germination energy发芽率/%
germination rateT1 55.67±3.79 bB 68.00±2.48 aA T2 60.00±4.97 aA 64.00±4.30 bB T3 50.67±5.17 cC 60.67±1.43 cC T4 45.33±3.79 dD 58.00±2.48 dC T5 40.00±2.48 eE 54.00±2.48 eD T6 31.33±3.79 fF 45.67±2.87 fE T7 25.00±2.48 gG 37.00±2.48 gF T8 18.00±4.97 hH 32.00±2.48 hG 注:小写字母为方差分析LSD法0.05水平上差异,大写字母为方差分析LSD法0.01水平上差异;下同。
Note: Small and capital letters followed the data mean significant difference at 0.05 and 0.01 levels by LSD method, respectively; the same as below.表 3 铜锌复合胁迫对菜薹幼苗生长的影响
Table 3 Effects of combined copper and zinc stress on the seedling growth of Chinese flowering cabbage
处理treatment 苗高/cm seedling height 最长根长/cm the longest root length 单株鲜重/mg fresh weight per plant T1 1.64±0.06 aA 2.99±0.30 aA 18.32±0.90 aA T2 1.41±0.03 bB 0.46±0.09 bB 13.88±0.62 bB T3 1.20±0.15 cC 0.31±0.03 cC 12.88±0.46 cC T4 1.24±0.02 cC 0.17±0.02 dD 12.18±0.14 dD T5 0.98±0.11 dD 0.12±0.06 deDE 10.89±0.51 eE T6 0.73±0.06 eE 0.11±0.03 deDE 7.35±0.63 fF T7 0.59±0.10 fF 0.09±0.01 eDE 6.27±0.57 gG T8 0.50±0.12 gF 0.04±0.01 eE 5.47±0.39 hH 表 4 铜锌复合胁迫对菜薹子叶光合色素含量的影响
Table 4 Effects of combined copper and zinc stress on the photosynthetic pigment contents in cotyledon of Chinese flowering cabbage
处理
treatment叶绿素a/ (mg·g−1)
chlorophyll a叶绿素b/ (mg·g−1)
chlorophyll b总叶绿素/ (mg·g−1)
total chlorophyll类胡萝卜素 / (mg·g−1)
carotenoidT1 0.79±0.03 aA 0.20±0.03 aA 0.99±0.06 aA 0.19±0.01 aA T2 0.57±0.01 bB 0.11±0.01 bB 0.68±0.02 bB 0.16±0.00 bB T3 0.50±0.01 cC 0.08±0.00 cC 0.58±0.02 cC 0.15±0.01 cC T4 0.33±0.02 dD 0.07±0.02 cC 0.40±0.02 dD 0.10±0.01 dD T5 0.24±0.01 eE 0.07±0.01 cC 0.31±0.01 eE 0.07±0.00 eE T6 0.14±0.01 fF 0.04±0.01 dD 0.18±0.02 fF 0.05±0.01 fF T7 0.09±0.01 gG 0.02±0.01 eD 0.11±0.01 gG 0.04±0.01 gG T8 0.06±0.00 hH 0.03±0.01 eD 0.09±0.01 hH 0.02±0.00 hH 表 5 铜锌复合胁迫对菜薹子叶可溶性蛋白质、可溶性糖、MDA和脯氨酸含量的影响
Table 5 Effects of combined copper and zinc stress on the protein, soluble sugar, MDA and proline contents in cotyledon of Chinese flowering cabbage
处理
treatment可溶性蛋白质/ (mg·g−1)
soluble protein可溶性糖/ (nmol·g−1)
soluble sugar丙二醛/ (nmol·g−1)
MDA脯氨酸/ (μg·g−1)
proline contentT1 12.79±0.46 bC 7.71±0.91 bB 18.97±0.96 dC 188.23±18.13 dD T2 12.85±0.50 bC 8.04±0.65 bB 16.47±3.34 eD 257.78±6.04 cC T3 12.67±1.16 bC 8.48±0.91 bB 16.53±1.01 eCD 361.77±12.54 bB T4 15.46±2.21 aA 11.24±1.29 aA 15.17±0.61 eD 452.96±11.81 aA T5 13.09±0.77 bBC 10.92±1.84 aA 22.45±3.47 cB 260.03±15.57 cC T6 14.48±0.56 aAB 8.54±2.17 bB 24.32±3.63 Bb 202.26±12.29 dD T7 12.86±1.98 bC 7.77±1.81 bB 27.27±1.61 aA 141.80±11.68 eE T8 12.58±1.16 bC 5.43±0.95 cC 28.04±2.58 aA 135.45±12.13 eE -
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1. 罗兴礼,彭伟,刘波,郑丽,殷发胜,陈业高. 小花姜花根茎的化学成分研究. 海南师范大学学报(自然科学版). 2024(02): 189-194 . 百度学术
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