虫草是一种寄生于昆虫的真菌，是广义虫草属(Cordyceps s.l.)真菌的总称，具有调节免疫力、抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性^[1-2]。冬虫夏草是其中的极品，具有巨大的市场需求，但其野生资源非常稀缺，已被列为中国二级保护物种^[3-4]。近年来，一些新的虫草陆续被发现，广义虫草属物种及相关虫生真菌中还有许多种类的活性成分和药用功效未做科学评估，大量虫草资源尚需要进一步深入研发^{[1, 5]}。

兰坪虫草(Ophiocordyceps lanpingensis H. Yu & Z. H. Chen)是线虫草属的新物种，主要分布于滇西北地区横断山脉纵谷地带，是冬虫夏草的近缘种，具有重要的药用和食用价值 ^[6-7]。虫草中的多种化学成分影响其药理价值，但兰坪虫草的化学成分及药效作用的物质基础尚不明确，势必会阻碍其资源的开发利用，因此有必要加强相关研究工作。本研究采用薄层层析色谱分析(TLC)方法快速筛选兰坪虫草优良菌株，并以之作为菌种材料，采用多种方法对兰坪虫草菌发酵产物不同极性部分的化学成分进行分离提取，并对获得的单体化合物进行分析鉴定。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

从新鲜兰坪虫草菌核部位分离得到49株兰坪虫草菌株，并作为材料来筛选优良菌株。其中15株来自营盘样地(OLYP 45~60)，14株来自水奉样地(OLSF1~14)，10株来自大羊场样地(OLLJ 1~5，OLLJ 20~25)，10株来自白里塘样地(OLBL 15~25)。各菌株都保存于云南大学云百草实验室。

1.2   优良菌株的筛选

1.2.1   液体发酵培养

将各菌株分别接入液体马铃薯粉培养基(2%蔗糖、2%马铃薯粉、1%蛋白胨，自然pH)，每100 mL接入1 cm²活化好的菌块。在摇床上120 r/min、20 ℃恒温培养15 d，再静止培养30 d，培养基表面长成厚厚的菌苔。将菌苔于40 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎过60目筛，得到兰坪虫草发酵培养菌丝体粗粉，装入自封袋中，编号。

1.2.2   代谢产物的乙醇粗提

兰坪虫草发酵培养菌丝体粗粉用95%乙醇(样品：溶剂=1:4)室温浸泡24 h，4层纱布过滤。重复进行3次提取并合并滤液，经旋转蒸发浓缩后转移到样品管中，4 ℃保存。

1.2.3   TLC筛选^[8]

用毛细管将各菌株的代谢产物乙醇粗提液滴加于薄层板上。展开剂为乙酸乙酯：石油醚=9:1/20:1，显色剂为10%硫酸乙醇。烘烤至显色清晰后照相。

1.3   优良菌株的化学成分研究

1.3.1   代谢产物的粗提

将筛选出的优良菌株进行液体发酵培养，取其发酵培养菌丝体粗粉3.5 kg，加入14 L 95%乙醇(样品：溶剂=1:4)，经过乙醇粗提后得到提取浸膏258 g。提取后剩余残渣进行干燥，加5倍水，煮沸0.5 h，用纱布重复过滤3次，合并滤液并蒸干，得到769 g水提粗品。

1.3.2   乙醇粗提物的进一步分离纯化

将258 g乙醇提取浸膏取58 g留样保存，剩余部分加100 mL蒸馏水溶解，先后用石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇3种溶剂分别进行萃取，得到石油醚部分(A=64 g)、乙酸乙酯部分(B=31 g)和无水乙醇部分(C=57 g)。

取A部分提取物15 g与15 g硅胶混匀后用硅胶柱进行层析。77 cm×4.2 cm的硅胶柱填充200目硅胶500 g。采用梯度洗脱，洗脱剂依次为乙酸乙酯∶石油醚=0:1→1:20→1:9→1:4→2:3→1:1→1:0，浓缩收集液并进行TLC筛选，同类分段进行合并。

取B部分提取物20 g与20 g硅胶混匀后用色谱柱进行层析，160 cm×4.5 cm的色谱柱填充200目硅胶800 g。采用梯度洗脱，洗脱剂依次为乙酸乙酯∶石油醚=1:20→1:10→1:9→1:4→2:3→1:1→1:0和乙酸乙酯:甲醇=9:1→7:1→3:2→1:1→0:1，浓缩收集液并进行TLC筛选，同类分段进行合并。

取C部分提取物20 g与20 g硅胶混匀后用色谱柱进行层析，160 cm×4.5 cm的色谱柱填充200目硅胶800 g。采用梯度洗脱，以乙酸乙酯:甲醇=40:1→30:1→20:1→10:1→5:1→3:2→无水乙醇→80%乙醇→60%乙醇→双蒸水，浓缩收集液并进行TLC筛选，同类分段进行合并。

1.3.3   单体化合物的鉴定

将分离清晰、显色亮度高的条带作为目标化合物进一步分离纯化，通过凝胶柱层析分离纯化得到单体化合物，并通过核磁共振氢谱、碳谱测定方法对这些化合物的结构进行鉴定。核磁共振波谱分析由中国科学院昆明植物研究所分析测试中心完成。

2.   结果与分析

2.1   兰坪虫草菌株的TLC化学筛选

各兰坪虫草菌株的代谢产物采用小极性展开剂[V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:3]进行TLC筛选，结果(图1A)在365 nm波长和254 nm波长紫外灯下显色分别有1条色带显现；10%硫酸乙醇显色，色带数量不同，数量多的表示成分丰富。从49株菌中挑选出19株色带清晰、成分丰富的菌株。对初筛获得的19株菌株进行重复筛选，得到最优的4株菌，分别为OLSF3、OLYP47、OLBL21、OLLJ22。

图  1  兰坪虫草优良菌株的TLC筛选

注：A.小极性成分的复筛；B.大极性成分的复筛；C.腺苷和虫草素的复筛。

Figure  1.  Screening excellent of O. lanpingensis isolates by TLC

Note: A. affination of low polarity composition; B. affination of high polarity composition; C. affination of adenosine and cordycepin.

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各兰坪虫草菌株的代谢产物采用大极性展开剂[V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(丙酮)=8∶3∶1]进行TLC筛选，结果(图1B)在365 nm和254 nm波长紫外灯下显色条带不清晰，则不作为筛选指标；以10%硫酸乙醇显色色带数量多、色带清晰作为筛选指标。初筛得到19株菌株，通过复筛确定其中4株菌最优，分别为OLBL15、OLSF3、OLBL21、OLLJ22。

产腺苷和虫草素菌株的TLC筛选采用展开剂[V(水):V(丙酮):V(甲醇):V(氯仿)=0.5:1:3:8]进行，虫草腺苷和虫草素在254 nm波长的紫外灯下显出清晰色带，初筛得到8株在对照品相应位置色带清晰的菌株(图1C)，通过复筛确定其中4株菌最优，分别为OLBL15、OLBL16、OLLJ4、OLLJ22。

综合各项筛选指标获得7株优良菌株，分别为OLBL15、OLBL21、OLBL16、OLLJ22、OLLJ4、OLSF3、OLYP47，其中综合指标最好的菌株为OLLJ22 (图2)。

图  2  TLC筛选得到的优良菌株

注：A.小极性成分；B.大极性成分；C.产腺苷和虫草素。

Figure  2.  Excellent isolates screened by TLC

Note: A. low polarity composition; B. high polarity composition; C. adenosine and cordycepin.

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2.2   兰坪虫草菌株OLLJ22化学成分的研究

2.2.1   不同极性部分粗提物的分离

将兰坪虫草菌株OLLJ22的发酵培养物粗粉3.5 kg，采用不同极性溶剂对进行分离提取，获得水提粗提物最多，石油醚和乙酸乙酯提取物为小极性粗提物(表1)。将乙醇提取浸膏于4 ℃静置1周，有结晶析出，滤纸过滤，反复重结晶形成白色针状结晶(图3)，收率为0.52%。对该结晶进行D-甘露醇含量测定，结果其纯度达99%，说明该结晶的主要成分为D-甘露醇。

表  1  不同极性部分粗提物的收率

Table  1.  Yield of crude extracts at different polarity

溶剂 solvent	石油醚 petroleum ether	乙酸乙酯 ethyl acetate	乙醇 ethanol	水 water
粗提物质量/g quality of crude extracts	83	40	258	769
收率/% yield	2.37	1.14	7.40	21.97

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图  3  D-甘露醇的重结晶提取

Figure  3.  D-mannitol extracted by recrystallization

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乙醇提取浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯和无水乙醇进行分离萃取。石油醚部分进行硅胶柱层析，以石油醚∶乙酸乙酯进行梯度洗脱，TLC筛选得到9段粗品(A1~A9)。乙酸乙酯部分进行色谱柱层析，以石油醚∶乙酸乙酯进行梯度洗脱，筛选得到7段粗品(B1~B7)；以乙酸乙酯∶甲醇进行梯度洗脱，得到5段粗品(B8~B12)。无水乙醇部分进行色谱柱层析，以乙酸乙酯∶甲醇进行梯度洗脱，TLC筛选得到10段粗品(C1~C10)。

2.2.2   粗提物的分离纯化

经过TLC分析，对点板条带清晰的8个分段(A2、A3、A5、B4、B7、B8、C2、C3)进行进一步地分离纯化，结果只从4个分段(A3、B4、B7、C2)中获得较纯的单体(图4)。

将A3段粗品用干法上硅胶柱，用5组洗脱剂[乙酸乙酯、V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:10、V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:4、V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:1和石油醚]分别进行洗脱，得到A3A1~A3A6共6段样品。其中A3A1和A3A6这两段样品的成分种类少、量较多，条带较清晰，用硅胶柱进一步分离得到两个单体，即化合物1(A3-1)和化合物2(A3-6)。

将B4段粗品用干法上硅胶柱，用3组洗脱剂[乙酸乙酯、V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:1和石油醚]分别进行洗脱，得到B4B1~B4B3共3段样品。其中对B4B2段进一步分离后得到一个单体，即化合物3(B4-1)；B4B1和B4B3这两段样品虽条带清晰，但因量过少而没有进一步分离。

图  4  兰坪虫草发酵液粗提物的分离纯化

Figure  4.  Purification of the crude extracts from O. lanpingensis fermentation solution

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将B7段粗品上硅胶柱，用3组洗脱剂[V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:10、V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:3和V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:1]分别进行洗脱，得到B7B1~B7B7共7段样品。将B7B1上凝胶柱，用洗脱剂[V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:4]进行洗脱得到1个单体，即化合物4(B7-1)。将B7B4上硅胶柱，用洗脱剂[V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:3]进行洗脱得到1个单体，即化合物7(B7-2)。其余5段样品的TLC点板条带也较清晰，但因量过少而没有进一步分离。

将C2段粗品干法上硅胶柱，用5组洗脱剂[V(乙酸乙酯):V(石油醚)=1:1、V(乙酸乙酯):V(甲醇)=40:1、V(乙酸乙酯):V(甲醇)=20:1、V(乙酸乙酯):V(甲醇)=10:1和甲醇]分别进行洗脱，得到C2C1~C2C6共6段样品。将C2C1进一步用硅胶柱分离得到1个单体，即化合物5(C2-1)。将C2C3重结晶进一步纯化得到1个单体，即化合物6(C2-2)。其余4段样品因量太少而未进一步分离。

2.3   单体化合物的鉴定

从兰坪虫草发酵培养物不同极性部分粗提物中分离纯化的7个单体化合物，通过氢谱、碳谱测定方法进行了鉴定(图5)，确定化合物1为一种脂肪酸，化合物2为一种甘油酯，化合物3为β-谷甾醇，化合物4为乌苏酸，化合物5为D-甘露醇，化合物6为一种有机酸，化合物7为尿苷。这些化合物都具有重要的生理活性，尤其是从乙酸乙酯部分纯化得到的β-谷甾醇和乌苏酸，及从无水乙醇部分纯化得到的D-甘露醇具有较重要的生理活性。

图  5  单体化合物的氢谱和碳谱

注：A和B、C和D、E和F、G和H、I和J、K和L分别是化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6的氢谱和碳谱。

Figure  5.  Hydrogen spectrums and carbon spectrums of the pure compounds

Note: A and B, C and D, E and F, G and H, I and J, K and L, respectively were hydrogen and carbon spectrums of compound 1, compound 2, compound 3, compound 4, compound 5 and compound 6.

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3.   讨论

虫草药理作用的物质基础是近年来的研究热点。兰坪虫草属于线虫草属的新物种，对其化学成分的研究具有重要意义。

孙忠华等^[9]用硅胶柱、凝胶柱、薄层层析等分离纯化方法，用核磁共振氢谱、碳谱及质谱鉴定方法，从江西虫草菌丝体的石油醚提取层中分离到十八烷酸-α-单甘油酯、二十四烷酸，从乙酸乙酯提取层中分离到尿嘧啶、腺嘌呤、腺嘌呤核糖核苷、尿嘧啶核苷、3'甲氧基尿嘧啶核苷、丁二酸、烟酸。本研究对兰坪虫草各菌株的发酵液进行TLC筛选，得到的优良菌株用多种柱层析方法进行次生代谢产物的分离提取，并用核磁共振氢谱、碳谱技术鉴定化学结构。兰坪虫草菌发酵培养物的醇提(95%乙醇)部分粗提物的主要成分为D-甘露醇，水提部分主要成分为多糖。醇提部分再用石油醚、乙酸乙酯和无水乙醇3种不同极性溶剂进行分离提取，从不同部分分别提取到不同极性的多种成分。刘柏岑等^[10]研究认为：戴氏虫草菌丝体抑制肿瘤细胞增殖活性部位为石油醚和乙酸乙酯萃取部位，从中分离到壬二酸、麦角甾醇、亚油酸甲酯、亚油酸等化合物。兰坪虫草菌的石油醚和乙酸乙酯部分也分离到类似的酸类、醇类、酯类化合物，而核苷、碱基主要存在于乙酸乙酯部分，这也与孙忠华等^[9]的研究结果是一致的。石油醚部分比较粘稠和难分离，含有较多的胶体状物质，容易堵塞层析柱；从该部分得到9段粗提物，并纯化到2个单体化合物，初步鉴定为脂肪酸和甘油酯。乙酸乙酯部分的成分虽种类丰富，但多数含量过少，难于纯化得到单体；从该部分得到12段粗提物，并纯化得到3个单体化合物，分别鉴定为β-谷甾醇、乌苏酸和尿苷。无水乙醇部分可能含多糖类成分较多，在紫外灯下不显色，用10%硫酸乙醇显色出现暗斑；从该部分得到10段粗提物，并纯化得到2个单体化合物，分别鉴定为D-甘露醇和有机酸。

从兰坪虫草菌发酵培养物不同极性部分粗提物中分离纯化到多种粗提物，并鉴定到7个单体化合物，为探明该新物种的活性物质及其药效作用的物质基础提供参考依据。不同极性部分都可得到多种粗提物，但只鉴定了7个单体化合物，下一步研究可以通过改进分离纯化流程或增加柱层析的上样量，很有希望纯化和鉴定到更多成分，尤其是乙酸乙酯部分的成分非常丰富，拟重点对该部分的成分进行纯化和分析。

虫草属真菌的代谢产物丰富多样，主要活性物质包括核苷类、多糖类、甾醇类、D-甘露醇、蛋白质、氨基酸和肽类等，其中腺苷常被认定为虫草及其真菌的主要质量控制指标^{[1, 7]}。本研究从兰坪虫草菌中分离纯化到的D-甘露醇、β-谷甾醇、尿苷、脂肪酸、甘油酯和有机酸6种化合物，在雪峰虫草、蛹虫草、戴氏虫草等多种虫草中都已有报道^[11-13]。D-甘露醇、β-谷甾醇、尿苷都是虫草中的重要药理活性成分^{[12, 14]}。D-甘露醇即虫草酸，具有利尿脱水、镇咳祛痰、抗衰老等功效，临床上可降低颅内压、脑血栓、肾衰竭等^[15-16]；β-谷甾醇是虫草中常见的甾醇类物质，有降低胆固醇、抗癌、抑制肿瘤、修复组织及止咳祛痰等多种作用^[17]。

本研究从兰坪虫草菌中分离的乌苏酸为首次在广义虫草属中发现。乌苏酸是1种五环三萜类化合物，主要从枇杷叶中提取得到，已发现存在于黄精、枸骨根、猕猴桃根、番石榴叶等多种天然植物中^[18-19]，但目前在虫草中未见报道。乌苏酸及其衍生物是重要的中药有效成分，具有抗肿瘤、抗菌消炎、降血糖、保肝护肝等多种药理活性，极有可能成为低毒高效的新型抗癌药物、糖尿病药物，具有良好的应用价值^[20]，但也有研究认为乌苏酸的作用具有浓度依赖性^[21]。兰坪虫草菌中乌苏酸的含量及其与兰坪虫草药效作用的关系有待进一步研究。