芦笋类黄酮合成及调控基因表达的初步研究
The Preliminary Study on Asparagus Flavonoids Synthesis and Its Regulatory Genes
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Keywords:
- asparagus /
- transcriptome /
- flavonoids metabolism /
- gene expression
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芦笋(Asparagus officinalis L.)，又名石刁柏，为天门冬科天门冬属多年生草本植物，嫩茎食用，是一种营养及药用保健价值极高的蔬菜[1]。芦笋含有的活性物质有黄酮类化合物、甾体皂苷、低聚糖、甾醇、谷胱甘肽、维生素及硒、锌等微量元素[2-5]。其中黄酮类分子(包括花色苷)具有清除超氧离子自由基、增加机体免疫力、抗肿瘤、降血压、降血脂等作用[6]。黄酮的组分与含量影响芦笋品质并决定芦笋保健价值。研究表明：芦笋的黄酮成分主要有芸香苷、矢车菊素、槲皮素等及其糖基化修饰衍生物[7-8]。商品芦笋可分为白、绿和紫色三类，其中绿芦笋中芸香苷含量最高，而紫芦笋中花色苷含量最高[9]。目前，许多模式植物类黄酮及花色苷的合成与调控已被阐明，但芦笋中芸香苷和花色苷合成途径及调控的研究报道较少。本研究结合基因组序列，采用绿芦笋格尔夫的两性株自交产生的雌性和雄性后代，分别在嫩茎期(采收商品笋，T)，花蕾期(A)和盛花期(B)，进行芦笋总黄酮含量的测定和RNA-Seq的基因表达变化分析，基于黄酮类物质含量与基因表达量的相关性，预测芦笋黄酮合成途径的关键合成酶及其表达调控的转录因子，为旨在提高芦笋黄酮含量等分子育种方面提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 芦笋材料
用绿芦笋品种格尔夫(Guelph Millennium)两性株自交后代的种子进行营养袋育苗，待苗开花并确定雌雄后，选大小和长势较一致的雌株与雄株各20株，按25 cm株距，140 cm行距规格种植于云南省砚山县江纳镇狮子山砚山禾普农业公司芦笋基地(海拔：1 540 m；经度：E 104°14’50”；纬度：N 23°41’3”)。生长2年后，选取出土15~20 cm长的商品笋(命名为T时期)、高80 cm花蕾时期小枝(命名为A时期)以及盛花期小枝(命名为B时期)，长势、大小和生理状态基本一致的雌雄株样品，并保存于−80 ℃备用。T时期分3次取样，A时期2次取样，B时期1次取样，第1次取样于2014年7月(雌雄T、A和B 3个时期6个样品)，第2次取样于2015年2月(雌雄T、A 2个时期4个样品)以及第3次取样于2016年10月(雌雄T时期2个样品)。
1.2 芦笋总黄酮含量测定
分别取雌、雄株8个植株的3个时期的样品，分别称取雌、雄芦笋3个时期(FT，FA，FB，MT，MA，MB)样品各0.2 g，参照穆宏磊等[10]测总黄酮的方法来测定芦笋各个时期样品中总黄酮的含量。使用SPSS分析各个时期含量的相关性。
1.3 芸香苷含量的测定
分别取FT和MT用80%的乙醇提取后，用反相高效液相色谱法进行分析。具体步骤为：用Hypersil GOLD柱(5 μm，250 mm×4.60 mm)为分析柱，设置柱温30 ℃。以不同比例的乙腈和水(磷酸调节pH 2.6)为流动相，控制流速为1 mL/min，梯度条件是0 min 8 %乙腈，10 min 70%乙腈，保持70%乙腈30 min；检测波长为254 nm。芸香苷标准品(Sigma产品)作为标准样，测定芸香苷的相对含量变化。
1.4 RNA提取、检测与测序
取雌、雄芦笋T时期(分3次生物学重复，FT1，FT2，FT3，MT1，MT2，MT3) 6个，A时期(分2次重复，FA1，FA2，MA1，MA2) 4样品和B时期(FB，MB) 2个，共 12个样品，采用CTAB方法提取总RNA交由百迈客(北京)测序公司(付费)完成RNA测序。具体是提取的总RNA质量用Agilent 2100 Bioanalyzer分析确定；将质量合格的总RNA，用带Oligo (dT)的磁珠吸附进行mRNA纯化，纯化的mRNA随机打断用作模板，用六碱基随机引物(random hexamers)反转录合成cDNA第1条链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第2条链，用于Illumina/Solexa高通量测序的文库构建；构建的测序文库，根据测序接头核苷酸序列设计引物，使用Phusion高保真DNA聚合酶，进行15个循环的PCR扩增，扩增产物经6% TBE PAGE电泳后，纯化150～200 bp大小的片段。纯化片段解链后，产生的单链分子被加载到Illumina测序芯片上并固定，每单条待测序分子经过原位扩增成为1个单分子族测序模板，加入4色荧光标记的dNTP，采用边合成边测序的方法完成测序，在测序过程中，计算机软件同步对荧光图像数据信号进行处理，来确定被测碱基，获转录组原始读段(raw reads)。
1.5 转录组数据分析
1.5.1 读段组装与功能注释
将12个样品的RNA-SEQ的净读段用SOAP de novo和Trinity软件完成转录组的组装和去冗余处理，得到尽可能长的非冗余Unigenes。将测序获得Unigenes与通过基因组测序预测的31 097个CDS (http://asparagus.uga.edu，Harkess A等，私人通讯)进行BLAST比对，获得芦笋基因组的中表达CDS。通过BLASTN (设置E-value≤10−15)，将获得的表达芦笋CDS序列比对NCBI的Nr (non-redundant)、Swiss-Prot和COG (cluster of orthologous groups)等数据库进行注释，同时进行GO (gene ontology)，KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes，http://www.kegg.jp/)和代谢通路富集(http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)分析，获得芦笋中表达CDS的功能注释。
1.5.2 芦笋类黄酮合成酶基因的预测与表达分析
以芦笋的基因组CDS作为参考序列，将每个样品的clean reads在参考CDS上做比对(mapping)得到每个表达CDS的读段数目；进一步进行表达CDS的FPKM的转化[11]。将FPKM数值0.01作为判断芦笋CDS是否表达的阈值。将表达的芦笋CDS进行KEGG代谢途径分析获得黄酮类代谢酶基因及以FPKM值表示的表达量。
1.5.3 黄酮类合成调控相关的转录因子的预测与表达分析
获取亚洲百合(Lilium hybrid)、文心兰(Oncidium hybrid)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大花牵牛(Ipomoea nil)、矮牵牛(Petunia × hybrid)等与黄酮或花色苷合成调控相关的转录因子序列，通过BLAST与芦笋CDS进行对比分析，获得芦笋中与上述序列同源的转录因子，基于转录组测序获得的表达量(FPKM)和总黄酮(包括芸香苷)含量的相关性来确定芦笋总黄酮合成的关键调控转录因子。
1.6 数据的收集与处理
序列同源比对用BLAST，数据用Excel进行收集与整理，统计分析用SPSS软件，基因表达随总黄酮含量的趋势分析用STEM软件。
2. 结果与分析
2.1 芦笋总黄酮的含量
用分光光度法分析芦笋总黄酮含量的结果显示格尔夫T时期(商品笋)雄株(MT)总黄酮含量为0.307 g/kg (FW)，其含量是雌株FT含量的1.96倍，A时期，雄株MA含量<雌株(FA)，B时期FB<MB (图1)。在不同的发育阶段，雄株随着发育阶段的变化，从MT，MA到MB总黄酮含量一直在增加，相应的雌株，A时期含量最多，变化趋势是FT<FB<FA (图1b)。因T时期是商品笋期，其含量对芦笋品质，特别是抗氧化等方面的保健价值影响较大，我们进一步用HPLC方法测定了绿芦笋中含量最丰富的黄酮化合物芸香苷的含量，结果表明T时期格尔夫芸香苷含量显示雌株小于雄株(图2)。
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图 1 芦笋总黄酮含量的测定注：a) 不同时期的样品形态；b) 总黄酮含量的变化；FT，FA，FB和MT，MA, MB分别是雌性和雄性格尔夫T、A和B时期样品，总黄酮含量为4次独立测定的平均值及标准差，通过SPSS软件进行方差分析，不同小写字母所代表的样品间存在(P=0.00，小于0.01)显著差异。Figure 1. Determination of Asparagus total flavonoidsNote：a) different sample for RNA-Seq，total flavonoids and rutin determination; b) the contests of total flavonoids, FT，FA，FB, MT，MA and MB are female and male Guelph Millennium sample collected in T, A and B phase. Value are mean of 4 independent determination plus standard errors and different lowercase letters indicate the significant difference (P=0.000，<0.01) between samples analysis by SPSS.2.2 RNA测序的序列组装
将12个转录组测序的原始读段，进行杂质过滤，剔除引物和低质量转录组序列数据后，获得2 970条净读段(clean read)，共55 G的碱基净测序数据(表1)，测定的序列中Q 20以上的占94.89%，不含不确定碱基(N)，GC碱基在所有碱基中在47.43%~50.15%之间，采用序列组装软件Trinity进行从头组装，获得非冗余Unigenes共71 302条。这些Unigenes对含31 096条的芦笋基因组测序预测的CDS (序列由NCBI获得，www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA317340)进行BLAST比对分析，设置BLASTN的E-value为1×10−15，发现多个Unigenes只比对到1个CDS，具有高度同源CDS为27 233个。说明这些CDS在芦笋中是表达的，检测CDS表达率占87.54%。这些表达的CDS序列再对NCBI NR数据库进行注释获得13 262条可注释CDS，注释率为48.7%。
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图 2 雌性和雄性芸香苷的HPLC测定分析注：芸香苷出峰时间为6.75 min。Figure 2. Determination of rutin by HPLC analysisNote：The retain time of rutin is about 6.75 min.表 1 格尔夫品种12个转录组的测序数据统计Table 1. Statistics of 12 RNA sequencing data of asparagus CV Guelph Millenniumsample ID样品号 clean reads净读段 clean base净碱基 Q20/% N/% GC/% FT1 11 697 623 2 924 405 750 95.48 0 49.54 FT2 16 611 012 4 184 816 586 94.34 0 50.15 FT3 46 170 870 6 925 630 500 96.16 0 47.52 FA1 12 840 175 3 210 043 750 95.74 0 48.37 FA2 49 513 214 7 426 982 100 96.16 0 48.12 FB 13 187 599 3 296 899 750 95.66 0 48.82 MT1 11 304 256 2 826 064 000 95.71 0 47.54 MT2 20 489 441 5 161 487 681 93.92 0 49.18 TT3 47 688 166 7 153 224 900 96.16 0 47.53 MA1 11 209 658 2 802 414 500 95.11 0 48.17 MA2 46 170 870 6 925 630 500 96.16 0 47.43 MB 10 169 932 2 542 483 000 95.26 0 48.79 2.3 表达的黄酮类合成与调控CDS的预测分析
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图 3 以矢车菊素和芸香苷为主的芦笋黄酮类化合物合成途径及调控注：a) PAL. 苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine ammonia-lyase)；4CL. 4香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate--CoA ligase)；CA4H. 肉桂酸4-羟基化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase)；CHS. 查尔酮合成酶(chalcone synthase)；CHI. 查尔酮异构酶(chalconeisomerase)；F3H. 类黄酮3-羟基化酶(flavanone 3-hydroxylase)；F3’H. 类黄酮3’羟基化酶(flavonoid 3’-hydroxylase)；F3’5’H. 类黄酮3’5’羟基化酶(flavanoid 3’, 5’-hydroxylase)；FLS. 黄酮醇合成酶(flavonol synthase)；UFGT. 黄酮醇3-O-糖苷转移酶(UDP-glucose: flavonol 3-O-glucosyltransferase)；RT. 黄酮醇3-O-葡萄糖，鼠李糖苷转移酶(flavonol 3-O-glucoside rhamnosyltransferase)；DFR. 二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase)；ANS. 花青素合成酶(anthocyanidin synthase)；3GT. 花青素-3-O-糖苷转移酶(UDP-glucose:cyanidin-3-O-glucosyltransferase)；UGT(3,5GT). 花青素-3,5-O-糖苷转移酶(anthocyanidin 3-O-glucoside 5-O-glucosyltransferase)。b) a. MYB类转录因子调控的结构基因；b. bHLH转录因子调控的结构基因；c. MYB和bHLH互作调控的结构基因; d. WD40的调控。Figure 3. The synthetic pathway and regulation of asparagus flavonoid, focusing on rutin and cyanidininsNote: a) PAL. phenylalanine ammonia-lyase; 4CL. 4-coumarate--CoA ligase; CA4H. cinnamic acid 4-hydroxylase; CHS. chalcone synthase; CHI. chalcone isomerase; F3H. flavanone 3-hydroxylase; F3’H. flavonoid 3’-hydroxylase; F3’5’H. flavanoid 3’, 5’-hydroxylase; FLS. flavonol synthase; UFGT. UDP-glucose: flavonol 3-O-glucosyltransferase; RT. flavonol 3-O-glucoside rhamnosyltransferase; DFR. dihydroflavonol 4-reductase; ANS. anthocyanidin synthase; 3GT. UDP-glucose: cyanidin-3-O-glucosyltransferase; UGT(3,5GT). anthocyanidin 3-O-glucoside 5-O-glucosyltransferase。b) a. The genes regulated by MYB; b. The genes regulated by bHLH; c. The genes regulated by MYB and bHLH; d. The genes regulated by WD40 transcription factor2.3.1 芦笋类黄酮合成途径分析
芦笋中含量高的类黄酮分别是芸香苷和矢车菊素糖苷[12]，以这两个化合物为代表，研究芦笋中芸香苷和矢车菊素糖苷的合成途径。将所有同源搜寻的类黄酮合成相关的表达CDS进行分类与汇总，以KEGG Pathway类黄酮代谢途径网络为依据，预测出芦笋中芸香苷合成主要途径为：苯丙氨酸(Phenylalanine)→肉桂酸(Trans-Cinnamate)→肉桂酰辅酶A(Cinnamoyl-CoA)→4-香豆酰辅酶A(4-Cinnamoyl-CoA)→柚皮素查尔酮(Naringenin chalcone)→柚皮素(Naringenin)→二氢山柰酚(Dihydrokaempferol)→山柰酚(kaempferol)→槲皮素(Quercetin)→槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Quercetin 3-O-glucoside)→芸香苷(Rutin)；及由柚皮素(Naringenin)→圣草酚(Eriodictyol)或(和)二氢山柰酚→二氢槲皮素(Dihydroquercetin)→白矢车菊素(Leucocyanidin)→矢车菊素(Cyanidin 3-O-glucoside)的合成途径(图3)。合成途径催化酶中，除苯丙氨酸脱氨酶(PAL)、类黄酮3-羟基化酶(F3H)、类黄酮3’5’羟基化酶(F3’5’H)、黄酮醇合成酶(FLS)、黄酮醇3-O-葡萄糖鼠李糖苷转移酶(RT)、花青素-3-O-糖苷转移酶(3GT)为单一表达基因外，其他基因均为2个或多个表达基因。预示上述单一表达的基因是黄酮类，特别是芸香苷和矢车菊素糖苷生物合成关键基因。
2.3.2 调控芦笋合成的转录因子的预测
目前在其他植物中确定参与类黄酮合成的转录因子有MYB，bHLH，WD40[13](图3)。MYB类是主要的调控类黄酮合成的转录因子，主要调控CHS，CHI，F3H以及FLS等合成基因[14-15]；bHLH转录因子主要调控DFR[16]；WD40对CHS，CHI和F3H之外的其他类黄酮合成基因均有一定的调控作用[17]。尤其值得注意的是bHLH蛋白与MYB蛋白结合，促进MYB调控结构基因ANS、3GT、DFR的表达改变[18]。
获取亚洲百合的bHLH类转录因子LhbHLH1[19](NCBI No. AB222075.1)，文心兰MYB类转录因子OgMyb1[20](NCBI No. ABS58501)，以及拟南芥TTG1 (NCBI No. CAB45372)、大花牵牛InWdr1(NCBI No. BAE94407)、矮牵牛的phAN11 (NCBI NO. U94748)等WD40蛋白[17, 21-22]的序列对已表达的芦笋CDS序列作同源比对分析(BLASTP E-value = 1×10−6)，预测了34个bHLH，27个MYB，28个WD40共89个转录调控因子，另与上述影响黄酮合成的转录因子同源的序列中还包括21 WRKY转录因子。
2.4 芦笋商品笋中类黄酮合成与调控因子的变化分析
2.4.1 类黄酮合成酶基因表达
在芦笋格尔夫发育的T，A，B时期，所有芦笋合成路线的合成酶基因均有不同程度的表达。在T时期查尔酮合成酶(AoCHS)，AoF3’5’H，AoF3H和Ao3GT表达不高, 这可能与芦笋T时期芸香苷及总类黄酮含量较A和B时期含量较低相关, 同时也预示这些酶催化T时期关键合成部位(图1~4)，芦笋黄酮类合成代谢中，检测到多个同工酶的表达。在Ｔ时期，花青素-3,5-O-糖苷转移酶(Ao3,5GT1)，花青素合成酶(AoANS1)，AoRT，AoFLS， 肉桂酸4-羟基化酶(AoCA4H1)等为主要表达基因，预示这些同工酶在T时期的合成代谢中发挥主要作用。因FT黄酮及芸香苷含量小于MT，而在雄株中AoANS1，AoCHI1，AoCHI2，AoF3’H，AoUFGT5的表达高于雌株，说明这几个基因T时期雌、差异表达与其雄株黄酮含量高于雌株相关。A时期为芦笋茎秆发育的花蕾期，其总黄酮含量高于T时期，并且雌株含量明显高于相同时期雄株，且是所测样品中含量最高达4.96 g/kg (FW)。该时期，Ao3,5GT1，4香豆酸辅酶A连接酶(Ao4CL2)，AoCHI4，AoCHS1，AoCHS2，二氢黄酮醇4-还原酶(AoDFR2)，黄酮醇3-O-糖苷转移酶(AoUFGT5、AoUFGT6)表达量较高，特别是AoCHS2和AoDFR2，相对于T和B时期，A时期表达加强，该时期相对于雄株，总黄酮含量雌株较高，而雌雄株间基因表达量相比，AoCA4H1，Ao4CL1，AoANS1，AoCHI1，AoCHI3，AoDFR4，AoPAL和AoUFGT3均是雌株表达高于雄株表达，表明这些基因存在差异表达，导致FA的总黄酮高于MA。所测雄株样品中，B时期总黄酮含量高，且高于相同时期的雌株。该时期基因表达模式与A时期相似，但该时期Ao3,5GT，4CL，UFGT2，UFGT3等基因相对于T，A时期有较高的表达，同时相对于雌株，AoCA4H1，AoANS1，AoCHI1，AoCHI2，AoCHI3，AoDFR2，AoDFR3，AoDFR4，AoF3’H2，AoF3’H3，AoFLS，AoUFGT2，AoRT呈现上调表达。在整个花色苷合成途径中，观测到催化矢车菊素3-O-葡糖苷合成的编码基因Ao3GT的表达很低，同时AoFLS尽在T、A时期高效表达，而B时期呈下调表达。
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图 4 芦笋T、A、B不同时期雌雄株间类黄酮合成酶基因的表达变化注：a)、b)、c) 分别是T、A、B时期芦笋类黄酮合成基因的表达情况；其中T和A时期分别是3次和2次转录组重复测定的平均值。Figure 4. Genes expression of flavonoid synthetase in males and female asparagus at T, A and B stages respectivelyNote: a), b) and c) are T，A，and B phase sample expression level of flavonoid synthase，the values of a) and b) are mean of 3 and 2 independent RNA-seq determinations.2.4.2 调控类黄酮代谢的转录因子基因的表达
通过LhbHLH1，OgMyb1，TTG1，InWdr1，AN11对已表达的芦笋CDS序列作同源比对分析确定有表达的110个预测的转录因子(见前述)，依据表达量变化，分别按雌株FT-FB-FA，雄株MT-MA-MB类黄酮含量递增的方式做趋势分析，筛选在雌、雄株总黄酮含量上升(表达量与黄酮含量正相关)和下降(表达量与黄酮含量负相关)的转录因子。在此基础上将上述正相关转录因子和负相关转录因子做并集获得芦笋类黄酮含量相关的基因共43个基因，其中包括bHLH 7个，MYB类15个，WD40类11个，WRKY类10个。进一步分析发现：在T时期WRKY类转录因子表达较低，而MYB类(包括AoMYB3，10，11，17，24，25)和WD40类(包括AoWD7，8，9，13，16，17，18)和bHLH (包括AobHLH10，11，26，32)表达较高。T时期雌株的总黄酮含量小于雄株，相应雄株AobHLH26，AoMYB10，17，3；AoWD7，13，16，17，18比雌株表达高，推测这些转录因子的差异表达可能决定了T时期雌雄株间黄酮含量的变化(图5a)。在A时期，bHLH (包括AobHLH13，14，26，27，32)，WD40类(AoWD2，7，8，9，13，16，17) MYB (AoMYB3，4，10，11，24)有较高表达。该时期，雄株(MA)总黄酮含量小于雌株(FA)的含量，而相应该时期雌株AobHLH13，14，32，AoMyb3，10，24，25，AoWD7，9，28表达大于雄株表达，预示在该时期，这些基因可能调控合成基因的表达导致雌、雄株间类黄酮含量的变化(图5b)。B时期芦笋中转录因子的表达模式与A时期相似，但WRKY类(包括AoWRKY4，6，13，14)相对于T和A时期总体上调表达(图5c)。在该时期MB总黄酮含量大于FB，相应的雄株中AobHLH8，32；AoMYB3，4，10，17，22；AoWD7的表达高于雌株，预示这种表达模式的变化导致了该时期雌、雄间总黄酮的含量差异。
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图 5 预测的黄酮类合成转录因子的表达变化注：a)、b)、c)分别是T、A、B时期芦笋类黄酮合成调控基因的表达情况；其中，T和A时期分别是3次和2次转录组重复测定的平均值。Figure 5. The expression changes of predicted transcription factors in flavonoids biosynthesisNote: a), b) and c) are expression level of regulated genes for flavonoid synthase in T, A, and B phase samples, the values of a) and b) are mean of 3 and 2 independent RNA-seq determinations.3. 讨论
芦笋为雌雄异株植物，本研究对格尔夫两性株自交后代中不同时期的雌雄样品进行转录组分析，并且着重分析T时期的表达变化，因为该时期是商品笋时期，与芦笋产业发展息息相关。其中重要的T时期和A时期，分别进行3次和2次生物学重复分析有利于消除背景的复杂性，来确定黄酮合成与积累相关基因。用T、A和B 3个时期的基因表达，来分析这些基因在芦笋整个生长发育过程中的表达变化。芦笋T时期用作具重要保健与药用价值的高档蔬菜为食，所以采取3次重复，着重分析，寻找商品笋时期雄株类黄酮含量优势的分子依据。黄酮含量决定商品芦笋和芦笋茶的品质。本研究结果显示：仅从黄酮的含量来说，鲜食芦笋的品质雄株优于雌株(图1)，加之雄芦笋有较高的产量和较强的抗逆性，阐明芦笋黄酮类合成与调控机制并进行全雄芦笋的选育等有重要的意义。表达量与含量相关性分析发现：AoCA4H1、AoANS1、AoCHI1为芦笋中类黄酮合成的重要基因。
在拟南芥菜[23]、金草鱼[24-25](Antirrhinum majus)和矮牵牛[26]等模式植物，辣椒[27] (Capsicum annuum)和番茄[28]等经济作物的黄酮化合物的合成与调控的机制已经研究得较为清楚，本研究利用NCBI中获取的上述基因序列，通过同源比对分析初步确定了芦笋黄酮的合成途径(图3)。黄酮的合成受转录因子的调控，其中MYB类为主要的转录因子，调控CHS、CHI、F3’5’H、DFR、ANS、3GT的表达[15]；bHLH类蛋白主要调控CHS、F3H、UFGT、DFR的表达，而WD40，作为蛋白互作的主要蛋白，参与黄酮合成调控中MYB和bHLH的互作[17]，本研究通过亚洲百合的LhbHLH1，文心兰MYB类转录因子OgMyb1及拟南芥TTG1、大花牵牛InWdr1、矮牵牛AN11 等WD40蛋白，获得芦笋中的同源CDS 110个，进一步通过不同样品间进行RNA测序获得调控基因表达与总黄酮含量趋势与相关性的分析，初步预测AobHLH32；AoMYB3，AoMYB 10，AoMYB 11和AoWD 7调控黄酮的合成的候选基因，为进一步确定这些基因的功能准备了条件。
芦笋嫩茎(T时期)在发育上花芽和叶芽分化的时期，同时也是采收食用的关键时期，黄酮的含量，雄株高于雌株，仅以具重要保健作用的黄酮成分而言，雄芦笋品质高于雌雌芦笋品质，加之雄株芦笋不形成果实，营养不会过多消耗，而增加产量和抗逆性，这进一步确定了芦笋全雄育种的重要性与迫切性。黄酮的合成与积累受光照时间的影响[30]，从T期到A时期(花蕾期)和B期(盛花期)，光照时间增加，总黄酮含量逐渐增加(图1)，A时期是配子形成与发育的初期，雌株芦笋类黄酮高于雄株，这说明雌株更需要类黄酮物质来保护雌配子发育，防止紫外线对配子体DNA的伤害。在B时期是芦笋授粉的关键时期，芦笋雄配子的DNA保护需要类黄酮物质的积累, 是完成芦笋传粉受精的关键[30]，柱头一旦接受花粉，将不再接受其他花粉并开始萎蔫与凋亡，所以这时期雌株对类黄酮的需求低于雄株，这与我们结果中总黄酮含量FA>MA, FB<MB相一致。
4. 结论
绿芦笋是市场上主要的芦笋蔬菜，作为绿芦笋品种的格尔夫，其两性株后代商品笋时期总黄酮含量雄株高于雌株，结合3个时期的相关性分析，推测出AoCA4H1、AoANS1、AoCHI1为芦笋中重要的类黄酮合成基因，这些基因在芸香苷和矢车菊素的合成中起着重要的作用，这将对提高芦笋中芸香苷和矢车菊素的含量提供分子基础。通过转录因子的表达量分析，初步确定AobHLH32、AoMYB3、AoMYB10和AoWD7为潜在的正调控转录因子，AoMYB11是潜在负调控转录因子。
通过芦笋转录组分析，首次获得芦笋中类黄酮代谢途径，并且预测了芦笋中类黄酮合成基因以及调控因子，为以后芦笋类黄酮代谢的人工改良奠定了基础。本研究发现雄芦笋在类黄酮含量上高于商品雌芦笋，雄笋在品质上优于雌株，这为芦笋全雄育种的优势提供了额外的分子基础。
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图 1 芦笋总黄酮含量的测定
注：a) 不同时期的样品形态；b) 总黄酮含量的变化；FT，FA，FB和MT，MA, MB分别是雌性和雄性格尔夫T、A和B时期样品，总黄酮含量为4次独立测定的平均值及标准差，通过SPSS软件进行方差分析，不同小写字母所代表的样品间存在(P=0.00，小于0.01)显著差异。
Figure 1. Determination of Asparagus total flavonoids
Note：a) different sample for RNA-Seq，total flavonoids and rutin determination; b) the contests of total flavonoids, FT，FA，FB, MT，MA and MB are female and male Guelph Millennium sample collected in T, A and B phase. Value are mean of 4 independent determination plus standard errors and different lowercase letters indicate the significant difference (P=0.000，<0.01) between samples analysis by SPSS.
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图 2 雌性和雄性芸香苷的HPLC测定分析
注：芸香苷出峰时间为6.75 min。
Figure 2. Determination of rutin by HPLC analysis
Note：The retain time of rutin is about 6.75 min.
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图 3 以矢车菊素和芸香苷为主的芦笋黄酮类化合物合成途径及调控
注：a) PAL. 苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine ammonia-lyase)；4CL. 4香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate--CoA ligase)；CA4H. 肉桂酸4-羟基化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase)；CHS. 查尔酮合成酶(chalcone synthase)；CHI. 查尔酮异构酶(chalconeisomerase)；F3H. 类黄酮3-羟基化酶(flavanone 3-hydroxylase)；F3’H. 类黄酮3’羟基化酶(flavonoid 3’-hydroxylase)；F3’5’H. 类黄酮3’5’羟基化酶(flavanoid 3’, 5’-hydroxylase)；FLS. 黄酮醇合成酶(flavonol synthase)；UFGT. 黄酮醇3-O-糖苷转移酶(UDP-glucose: flavonol 3-O-glucosyltransferase)；RT. 黄酮醇3-O-葡萄糖，鼠李糖苷转移酶(flavonol 3-O-glucoside rhamnosyltransferase)；DFR. 二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase)；ANS. 花青素合成酶(anthocyanidin synthase)；3GT. 花青素-3-O-糖苷转移酶(UDP-glucose:cyanidin-3-O-glucosyltransferase)；UGT(3,5GT). 花青素-3,5-O-糖苷转移酶(anthocyanidin 3-O-glucoside 5-O-glucosyltransferase)。b) a. MYB类转录因子调控的结构基因；b. bHLH转录因子调控的结构基因；c. MYB和bHLH互作调控的结构基因; d. WD40的调控。
Figure 3. The synthetic pathway and regulation of asparagus flavonoid, focusing on rutin and cyanidinins
Note: a) PAL. phenylalanine ammonia-lyase; 4CL. 4-coumarate--CoA ligase; CA4H. cinnamic acid 4-hydroxylase; CHS. chalcone synthase; CHI. chalcone isomerase; F3H. flavanone 3-hydroxylase; F3’H. flavonoid 3’-hydroxylase; F3’5’H. flavanoid 3’, 5’-hydroxylase; FLS. flavonol synthase; UFGT. UDP-glucose: flavonol 3-O-glucosyltransferase; RT. flavonol 3-O-glucoside rhamnosyltransferase; DFR. dihydroflavonol 4-reductase; ANS. anthocyanidin synthase; 3GT. UDP-glucose: cyanidin-3-O-glucosyltransferase; UGT(3,5GT). anthocyanidin 3-O-glucoside 5-O-glucosyltransferase。b) a. The genes regulated by MYB; b. The genes regulated by bHLH; c. The genes regulated by MYB and bHLH; d. The genes regulated by WD40 transcription factor
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图 4 芦笋T、A、B不同时期雌雄株间类黄酮合成酶基因的表达变化
注：a)、b)、c) 分别是T、A、B时期芦笋类黄酮合成基因的表达情况；其中T和A时期分别是3次和2次转录组重复测定的平均值。
Figure 4. Genes expression of flavonoid synthetase in males and female asparagus at T, A and B stages respectively
Note: a), b) and c) are T，A，and B phase sample expression level of flavonoid synthase，the values of a) and b) are mean of 3 and 2 independent RNA-seq determinations.
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图 5 预测的黄酮类合成转录因子的表达变化
注：a)、b)、c)分别是T、A、B时期芦笋类黄酮合成调控基因的表达情况；其中，T和A时期分别是3次和2次转录组重复测定的平均值。
Figure 5. The expression changes of predicted transcription factors in flavonoids biosynthesis
Note: a), b) and c) are expression level of regulated genes for flavonoid synthase in T, A, and B phase samples, the values of a) and b) are mean of 3 and 2 independent RNA-seq determinations.
表 1 格尔夫品种12个转录组的测序数据统计
Table 1 Statistics of 12 RNA sequencing data of asparagus CV Guelph Millennium
sample ID样品号 clean reads净读段 clean base净碱基 Q20/% N/% GC/% FT1 11 697 623 2 924 405 750 95.48 0 49.54 FT2 16 611 012 4 184 816 586 94.34 0 50.15 FT3 46 170 870 6 925 630 500 96.16 0 47.52 FA1 12 840 175 3 210 043 750 95.74 0 48.37 FA2 49 513 214 7 426 982 100 96.16 0 48.12 FB 13 187 599 3 296 899 750 95.66 0 48.82 MT1 11 304 256 2 826 064 000 95.71 0 47.54 MT2 20 489 441 5 161 487 681 93.92 0 49.18 TT3 47 688 166 7 153 224 900 96.16 0 47.53 MA1 11 209 658 2 802 414 500 95.11 0 48.17 MA2 46 170 870 6 925 630 500 96.16 0 47.43 MB 10 169 932 2 542 483 000 95.26 0 48.79 
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