拟南芥突变体npr1-2的鉴定及水杨酸感受性分析
Identification and Salicylic Acid Sensitivity Analysis of Arabidopsis Mutant npr1-2
-
Keywords:
- NPR1 /
- npr1-2 /
- homozygote /
- salicylic acid sensitivity
-
NPR1 (nonexpresser of pathogenesis-related genes1)基因在植物的系统获得抗性(systemic acquired resistance，SAR)中起关键的作用[1]。SAR为存在于植物中、以病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins，PR)表达为特征的广谱抗性，并需要水杨酸(salicylic acid, SA)信号转导的诱导[2]。CAO等[3]在1994年分离到1株缺乏水杨酸-2，6-二氯异烟肼(2,6-dichloroisonicotinic acid，INA)表达的拟南芥npr1突变株，该植株不能对各种SAR诱导物处理做出应答反应。随后NPR1得到了广泛深入的研究[4]，并成为植物水杨酸介导的抗病信号转导通路的标志基因。因此，在涉及水杨酸信号转导途径的研究中，npr1是一个重要的实验材料。本研究对经EMS (ethylmethane sulfonate)诱变的拟南芥npr1-2突变体的纯合性进行了检测，然后利用qRT-PCR技术对NPR1基因表达水平进行测定，并用水杨酸敏感性试验加以验证，为进一步研究NPR1与其他基因的关系，以及为水杨酸信号途径的功能研究提供试验材料。
1. 材料与方法
1.1 植物材料和种植管理
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia (Col-0)生态型。npr1-2突变体购自美国Lehle seeds公司，为Col-0生态型背景。种子用次氯酸钠消毒液浸泡10~15 min进行表面消毒；灭菌水冲洗3~5次，确保冲洗干净。将种子点播在固体Murashige Skoog (MS)培养基上，培养皿用parafilm封口膜封口，置于4 ℃冰箱中2~3 d进行春化处理。然后移入12 h光照/12 h黑暗、22 ℃的光照培养箱中。培养1周后，将幼苗逐苗移栽到装有V(营养土):V(蛭石)为2:1的小盆中，浇适量水后盖上透明塑料薄膜并放入组培室中培养，3 d后揭去薄膜，在拟南芥的生长过程中注意定期浇水和除虫管理。用于水杨酸敏感性试验的拟南芥种子播于含有28 μmol/L水杨酸的MS培养基上，进行垂直培养，以便观察根的生长情况。组培室的条件为：光照强度约50 μmol/(m2·s)，12 h光照/12 h黑暗，相对湿度60%~70%，温度22~23 ℃。
1.2 基因组 DNA 提取
按Edwards法提取[5]：从拟南芥植株上剪取叶子1~2 片，置于1.5 mL的离心管中研磨成匀浆。加入400 μL的Edwards提取液研磨后12 000 r/min离心。上清转移用异丙醇混匀，冰浴或−20 ℃放置5~10 min。12 000 r/min离心5 min，沉淀用70%的乙醇洗1次，在空气中干燥，溶于20~50 μL的灭菌水中，−20 ℃保存备用。
1.3 纯合突变体的鉴定
npr1-2为经化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate，EMS)诱变的点突变体[3]，在npr1-2的突变点附近，设计NPR1鉴定引物：5′-AGACTCTTGCCTCTTAGTGT-3′；5′-GAGCGAAACTATATGACGCC-3′。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker为Biomed 公司的BM2000+。电泳后，将清晰明亮的条带切下，由上海life有限公司测序，将测序结果与网站序列进行比对。
1.4 荧光实时定量PCR
利用Trizol法提取拟南芥组织总RNA，用分光光度计(NanoDrop 2000 Thermo Scientific，USA)测定浓度及OD260/OD280比值，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。按照HiScript II Q RT SuperM.ix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)说明操作，将待测RNA逆转录成cDNA。逆转录完毕后加入90 μL Nuclease-free H2O储存在−20 ℃冰箱备用。实时荧光定量RT-PCR测定利用QuantiFast® SYBR® Green PCR Kit试剂盒(Qiagen，Germany)在LightCycler® 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上进行反应，以18 sRNA基因作为内参，每个样品做3次重复。
2. 结果与分析
2.1 突变位点和纯合性鉴定
npr1-2为EMS诱变碱基替换突变，在突变位置附近设计引物，npr1-2的两引物之间的长度为575 bp；试验提取了9个不同npr1-2突变体株系叶片的DNA，用所设引物进行PCR扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到了9条预期的扩增条带(图1)。切割条带，进行DNA碱基序列的测定(图2)。
![]()
图 1 npr1-2突变位点片段的PCR扩增注：M. BM2000+ Marker; WT. 野生型；1~9. 9个不同npr1-2 株系。Figure 1. Amplification of mutant segment in npr1-2 plant by PCRNote：M. BM2000+ Marker; WT. wild type; 1~9. nine different strains of mutant npr1-2.将测序结果在TAIR网上与NPR1基因的序列进行对比，结果显示：npr1-2突变体的第152个碱基G突变成了A，即由野生型的半胱氨酸TGC突变为酪氨酸TAC，符合npr1-2所产生的点突变(图2)[1]。同时检测到npr1-2的杂合体和纯合体(图3)，保存纯合的npr1-2。
![]()
图 2 npr1-2突变片段的测序结果以及突变位点检测Figure 2. The sequencing results of mutant segment in npr1-2 plant2.2 纯合突变体npr1-2中NPR1基因的表达水平检测
通过利用荧光实时定量PCR对npr1-2纯合突变体植株中NPR1基因的表达量进行分析发现：突变体突变后，NPR1基因表达量明显下调(图4)。
![]()
图 4 野生型和npr1-2突变体中NPR1基因表达量注：**表示差异性达1%极显著水平。Figure 4. Expression of NPR1 gene in wild type and npr1-2 mutant plantsNote: ** indicates significant difference at 1% level.2.3 突变体对水杨酸的敏感性试验
NPR1在植物系统获得性抗性诱导中发挥作用的分子机制目前比较清楚，NPR1蛋白被认为是水杨酸的受体，通过感受和调节水杨酸的信号转导来启动病程相关基因(PR)的转录[4, 6]。因此NPR1突变后，植株对水杨酸的敏感性降低。利用高浓度水杨酸会抑制拟南芥根生长的特性，本研究将拟南芥种子播种于含水杨酸的MS培养基上，观察拟南芥幼苗的根生长情况，以了解突变体对水杨酸的响应变化。将npr1-2纯合突变体和野生型种子播于含有28 μmol/L水杨酸的培养基上，20 d时观察到野生型幼苗生长受到严重抑制，而 npr1-2突变体幼苗的生长受抑程度显著低于野生型，即其根长明显长于野生型(图5，表1)。上述研究结果表明：npr1-2纯合突变体对水杨酸敏感性下降是由NPR1基因表达量下调引起的。
![]()
图 5 野生型与npr1-2根对水杨酸的敏感性试验(Bar=1 cm)注：a) 野生型幼苗在不含SA的培养基上根生长情况； b) npr1-2幼苗在不含SA的培养基上根生长情况；c) npr1-2幼苗在含28 μmol/L SA的培养基上根生长情况；d) 野生型幼苗在含28 μmol/L SA的培养基上根生长情况。Figure 5. Response of wild type and npr1-2 seedlings to salicylic acid treatmentNote: a) root growth of WT seedlings on medium without SA; b) root growth of npr1-2 seedlings on medium without SA; c) root growth of npr1-2 seedlings on medium containing 28 μmol/L SA; d) root growth of WT seedlings on medium containing 28 μmol/L SA.表 1 水杨酸处理后野生型与npr1-2突变体根生长长度Table 1. Length of roots in wild type and npr1-2 mutant plants treated with salicylic acid植物类型plant type 处理treatment 根长度/cm length of roots 野生型wild-type 未处理untreated 3.448±0.566 a npr1-2突变体mutant of npr1-2 未处理untreated 3.137±0.664 ab 野生型wild-type 水杨酸处理treated with salicylic acid 0.802±0.035 Ac npr1-2突变体mutant of npr1-2 水杨酸处理treated with salicylic acid 1.731±0.050 BC 注：同列中不同小写字母表示差异性达5%显著水平；不同大写字母表示差异性达1%极显著水平。
Note: Different lowercases within the same column indicate significant difference at 5% level; different capital letters within the same column indicate significant difference at 1% level.3. 讨论
通过试验得到了拟南芥水杨酸信号转导缺陷突变npr1-2纯合植株，以此为材料，进行了实时荧光定量RT-PCR以及水杨酸敏感性鉴定实验，结果显示：纯合突变体npr1-2中NPR1基因表达量明显下调，并且突变体幼苗对水杨酸的敏感性显著降低。NPR1蛋白含有2个保守的蛋白-蛋白互作结构域，即N末端的BTB/POZ和中部的锚蛋白重复结构域，npr1-2突变发生在锚蛋白重复结构域中，使半胱氨酸(150氨基酸残基)突变为酪氨酸(400氨基酸)，导致无义密码子，产生丢失194个氨基酸C末端缺乏的水杨酸受体位点消失的截短蛋白[1]。CAO等[1]研究表明：npr1突变体具有对外施高浓度(5 mmol/L)水杨酸敏感的表型，认为是npr1突变体解毒功能下降所致，但没有呈现具体的实验结果。本研究将纯合的npr1-2突变体和野生型种子播种于含28 μmol/L 水杨酸的MS中，垂直培养20 d，发现水杨酸抑制了植物幼苗根的生长，但npr1-2幼苗根的受抑制程度明显低于野生型，我们推测npr1-2突变体对水杨酸感受的顿挫，导致其对较低浓度作为信号分子的水杨酸的敏感性降低。
-
![]()
图 1 npr1-2突变位点片段的PCR扩增
注：M. BM2000+ Marker; WT. 野生型；1~9. 9个不同npr1-2 株系。
Figure 1. Amplification of mutant segment in npr1-2 plant by PCR
Note：M. BM2000+ Marker; WT. wild type; 1~9. nine different strains of mutant npr1-2.
![]()
图 2 npr1-2突变片段的测序结果以及突变位点检测
Figure 2. The sequencing results of mutant segment in npr1-2 plant
![]()
图 4 野生型和npr1-2突变体中NPR1基因表达量
注：**表示差异性达1%极显著水平。
Figure 4. Expression of NPR1 gene in wild type and npr1-2 mutant plants
Note: ** indicates significant difference at 1% level.
![]()
图 5 野生型与npr1-2根对水杨酸的敏感性试验(Bar=1 cm)
注：a) 野生型幼苗在不含SA的培养基上根生长情况； b) npr1-2幼苗在不含SA的培养基上根生长情况；c) npr1-2幼苗在含28 μmol/L SA的培养基上根生长情况；d) 野生型幼苗在含28 μmol/L SA的培养基上根生长情况。
Figure 5. Response of wild type and npr1-2 seedlings to salicylic acid treatment
Note: a) root growth of WT seedlings on medium without SA; b) root growth of npr1-2 seedlings on medium without SA; c) root growth of npr1-2 seedlings on medium containing 28 μmol/L SA; d) root growth of WT seedlings on medium containing 28 μmol/L SA.
表 1 水杨酸处理后野生型与npr1-2突变体根生长长度
Table 1 Length of roots in wild type and npr1-2 mutant plants treated with salicylic acid
植物类型plant type 处理treatment 根长度/cm length of roots 野生型wild-type 未处理untreated 3.448±0.566 a npr1-2突变体mutant of npr1-2 未处理untreated 3.137±0.664 ab 野生型wild-type 水杨酸处理treated with salicylic acid 0.802±0.035 Ac npr1-2突变体mutant of npr1-2 水杨酸处理treated with salicylic acid 1.731±0.050 BC 注：同列中不同小写字母表示差异性达5%显著水平；不同大写字母表示差异性达1%极显著水平。
Note: Different lowercases within the same column indicate significant difference at 5% level; different capital letters within the same column indicate significant difference at 1% level.
下载: 导出CSV
-
[1] CAO H, GLAZEBROOK J, CLARKE J D, et al. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats[J]. Cell, 1997, 88(1): 57. DOI: 10.1016/S0092-8674(00)81858-9.
[2] KUMAR D. Salicylic acid signaling in disease resistance[J]. Plant Science, 2014, 228: 127. DOI: 10.1016/j.plantsci.2014.04.014.
[3] CAO H, BOWLING S A, GORDON A S et al. Characterization of an Arabidopsis mutant that is nonresponsive to inducers of systemic acquired resistance[J]. Plant Cell, 1994, 6: 1583. DOI: 10.1105/tpc.6.11.1583.
[4] PAJEROWSKA-MUKHTAR K M, EMERINE D K, MUKHTAR M S. Tell me more: roles of NPRs in plant immunity[J]. Trends in Plant Science, 2013, 18: 402. DOI: 10.1111/j.1365-2966.2011.18381.x.
[5] EDWARDS K J, JOHNSTONE C, THOMPSON C. A simple and rapid method for the preparation of plant genome DNA for PCR analysis[J]. Nucleic Acids Research, 1991, 19: 1349. DOI: 10.1093/nar/19.6.1349.
[6] WU Y, ZHANG D, CHU J Y, et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid[J]. Cell Reports, 2012, 1(6): 639. DOI: 10.1016/j.celrep.2012.05.008.
-
期刊类型引用(1)
1. 屈亚潭，陈盼，缑文昌，冯晓东. 外源水杨酸对黄瓜幼苗灰霉病防御酶活性的影响. 延安大学学报(自然科学版). 2024(03): 54-58 . 
百度学术
其他类型引用(1)
计量
- 文章访问数: 1819
- PDF下载量: 42
- 被引次数: 2
