基于RNA-Seq的镉、铅胁迫下间作续断菊根差异基因的转录组分析
Transcriptome Analysis of the Root of Sonchus asper under Cadmium and Lead Stress in the Intercropping System with RNA-Seq
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Keywords:
- intercropping /
- Sonchus asper /
- heavy metals /
- transcriptome
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滇姜花(Hedychium yunnanense)为姜科(Zingiberaceae)姜花属(Hedychium)植物，主要分布于中国的云南省、四川省、广西壮族自治区[1]，植物化学研究显示该植物主要包含二萜[2-5]、倍半萜[6-7]等成分，其中部分二萜化学成分显示细胞毒活性和抑制巨噬细胞中NO产生的活性，如本课题组在前期研究中发现滇姜花中二萜化合物hedychenoids B、hedychenone、villosin对肿瘤细胞SGC-7901的生长有抑制作用，化合物hedychenoids B、villosin对巨噬细胞中NO的产生有抑制作用[5]。近年来，作者揭示了多种姜科植物的化学成分及其活性[8-11]，为了继续进行该方面的研究，本研究对滇姜花根部的次生代谢产物进行了分离和鉴定，其研究结果将对滇姜花的合理开发和利用提供一定的数据支持。
1. 材料与方法
1.1 仪器与材料
试验样品于2013年采于云南省西双版纳州勐腊县，由中国科学院西双版纳热带植物园谭运红副研究员鉴定为滇姜花(H. yunnanense)。
质谱用API Qstar Pulsar型质谱仪测定；核磁共振谱用Bruker AM-400核磁共振仪测定，TMS为内标；HPLC为Agilent 1260液相色谱仪；薄层层析板和色谱硅胶由青岛海洋化工厂生产；MCI为日本三菱公司生产；TLC检测通过10%硫酸-乙醇溶液加热观察点样斑点。
1.2 提取与分离
干燥的滇姜花根5.0 kg，粉碎后用乙醇热提3次，减压蒸馏，得浸膏323 g；将浸膏分散于蒸馏水中，分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，得乙酸乙酯部分170 g；用石油醚-丙酮(9∶1-1∶1)对乙酸乙酯部分进行硅胶柱色谱分离，梯度洗脱，得到6个部分(F1-F6)；对F3 (8 g)进行硅胶柱色谱[氯仿-丙酮(20∶1)]分离，得到4个部分F3.1-3.4，其中F3. 4再经硅胶柱色谱[石油醚-乙酸乙酯(8∶2)、氯仿-乙酸乙酯(9∶1)]分离，得到化合物1 (2 mg)、2 (2 mg)、3 (3 mg)；对F4 (13 g) 进行硅胶柱色谱[氯仿-乙酸乙酯(10∶1)]分离，得到5个部分F4.1-4.5，其中F4.2经硅胶柱色谱[石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、石油醚-丙酮(3∶1)]分离，再经MCI纯化，得到化合物4 (3 mg)、5 (3 mg)、6 (4 mg)。化合物1~6结构如图1所示。
2. 结果与分析
化合物1：黄色粉末状固体。ESI-MS m/z: 329 [M+1]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 12.66 (1H, s, 5-OH), 8.07 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2′, 6′), 7.02 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.44 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.35 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-6), 3.90 (3H, s, 3-OCH3), 3.87 (3H, s, 7-OCH3), 3.86 (3H, s, 4′-OCH3); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 178.8 (s, C-4), 165.4 (s, C-7), 162.0 (s, C-5), 161.6 (s, C-4′), 156.7 (s, C-9), 155.9 (s, C-2), 138.8 (s, C-3), 130.1 (d, C-2′, C-6′), 122.8 (s, C-1′), 114.0 (d, C-3′, C-5′), 106.0 (s, C-10), 97.8 (d, C-6), 92.1 (d, C-8), 60.1 (q, 3- OCH3), 55.8 (q, 7- OCH3), 55.4 (q, 4′- OCH3)。以上数据与文献[12]报道的基本一致，故鉴定化合物1为5-羟基-3,7,4′-三甲氧基黄酮(5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone)。
化合物2：黄色粉末状固体。ESI-MS m/z: 343 [M+1]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.94 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.88 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.34 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.18 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 3.98 (3H, s, -OCH3), 3.82 (3H, s, -OCH3), 3.77 (6H, s, -OCH3); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.6 (s, C-4), 163.4 (s, C-7), 160.7 (s, C-5), 160.4 (s, C-4′), 158.5 (s, C-9), 152.2 (s, C-2), 140.6 (s, C-3), 129.3 (d, C-2′, C-6′), 122.7 (s, C-1′), 113.5 (d, C-3′, C-5′), 109.0 (s, C-10), 95.3 (d, C-6), 92.0 (d, C-8), 59.4 (q, -OCH3), 56.0 (q, -OCH3), 55.4 (q, -OCH3), 55.0(q, -OCH3)。以上数据与文献[12]报道的基本一致，故鉴定化合物2为3,5,7,4′-四甲氧基黄酮(3,5,7,4′-tetramethoxyflavone)。
化合物3：黄色粉末状固体。ESI-MS m/z: 343 [M+1]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.82 (2H, d, J = 9.2 Hz, H-2′, 6′), 7.01 (2H, d, J = 9.2 Hz, H-3′, 5′), 6.81 (1H, s, H-5), 6.60 (1H, s, H-3), 3.98 (3H, s, 8-OCH3), 3.97 (3H, s, 6-OCH3), 3.93 (3H, s, 7-OCH3), 3.89 (3H, s, 4′-OCH3)； 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 177.1 (s, C-4), 162.0 (s, C-4′), 161.2 (s, C-2), 157.5 (s, C-6), 154.6 (s, C-9), 152.5 (s, C-8), 140.4 (s, C-7), 127.8 (d, C-2′, 6′), 123.8 (s, C-1′), 114.5 (d, C-3′, 5′); 112.7 (s, C-10), 107.0 (d, C-3), 96.3 (s, C-5), 62.1 (q, 8-OCH3), 61.5 (q, 7-OCH3), 56.2 (q, 6-OCH3), 55.4 (4′-OCH3)。以上数据与文献[13]报道的基本一致，故鉴定化合物3为6, 7, 8, 4′-四甲氧基黄酮(6,7,8,4′-tetramethoxyflavone)。
化合物4：无色晶体。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.95 (3H, s, -OCH3), 7.03 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.37-7.40 (2H, m), 9.82 (1H, s, -CHO); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 191.0 (d, -CHO), 151.7 (s, C-4), 147.1 (s, C-3), 129.8 (s, C-1), 127.6 (d, C-6), 114.4 (d, C-5), 108.7 (d, C-2), 56.1 (q, 3-OCH3); EIMS m/z: 152 (M+, 60), 151 (72), 81 (100)。以上数据与文献[14]报道的基本一致，故鉴定化合物4为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)。
化合物5：白色晶体。ESI-MS m/z: 155 [M+1]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 6.70 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5), 6.46 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-2), 6.34 (dd, 1H, J = 8.8, 2.4 Hz, H-6), 3.79 (3H, s, -OCH3), 3.76 (3H, s, -OCH3);13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 150.3 (s, C-1), 149.8 (s, C-3), 142.9 (s, C-4), 112.5 (d, C-5), 105.9 (d, C-6), 100.6 (d, C-1), 56.6 (q, -OCH3), 55.7 (q, -OCH3)。以上数据与文献[15]报道的基本一致，故鉴定化合物5为3,4-二甲氧基苯酚(3,4-dimethoxyphenol)。
化合物6：无色晶体。ESI-MS m/z: 209 [M+1]+。1H NMR (Acetone-d6) δ 8.27 (1H, s, OH), 7.69 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-7), 7.42 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2), 7.24 (1H, dd, J = 1.8 和 8.2 Hz, H-6), 6.97 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5), 6.49 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-8), 4.01 (3H, s, 9-OCH3), 3.82 (3H, s, -OCH3); 13C NMR (Acetone-d6) δ 167.1 (C-9), 149.3 (C-3), 147.9 (C-4), 144.9 (C-7), 126.6 (C-1), 123.1 (C-6), 115.3 (C-8), 114.7 (C-5), 110.5 (C-2), 55.5 (-OCH3), 50.7 (9-OCH3)。以上数据与文献[16]报道的基本一致，故鉴定化合物6为methyl ferulate。
3. 讨论
本研究从滇姜花根部中分得6个酚性化合物，经波谱分析和文献报道数据对照，鉴定所分离的6个化合物的结构分别为5-羟基-3,7,4′-三甲氧基黄酮(1)、3,5,7,4′-四甲氧基黄酮(2)、6,7,8,4′-四甲氧基黄酮(3)、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(4)、3,4-二甲氧基苯酚(5)、methyl ferulate (6)。其中化合物1~3为黄酮类化合物，以上化合物均为首次从该植物中分离得到。赵庆等[3, 13]发现滇姜花中多个二萜具有细胞毒活性，并且对滇姜花粗提物、滇姜花素A、姜花酮进行了动物体内抗肿瘤活性测试，结果表明它们均能显著性抑制小鼠体内移植性肿瘤H22的生长，其中滇姜花素A对小鼠H22肿瘤生长抑制率达54.27%，作用最强；李玉鹏等[5]发现滇姜花中部分二萜对NO产生有抑制作用。但是还没有文献报道该植物中酚性成分的分离和药理作用，本课题组将以上述物质为基础，进一步开展相关活性研究，为其合理开发提供依据。
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图 1 续断菊Cd 、Pb含量(n=3)
注：M.单作；I.间作；不同字母表示差异显著(P<0.05)；下同。
Figure 1. The contents of Cd and Pb in S. asper
Notes: M. monoculture; I. intercropping; Different letters indicate significant difference (P<0.05); the same as below.
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图 5 续断菊组间GO功能分类图汇总
注：up表示间作的基因表达上调；down表示间作的基因表达下调。
Figure 5. MSR-VS-ISR functional classification of GO
Notes: Up means the up regulation of genes after intercropping; down means the down regulation of genes after intercropping.
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图 6 参与内吞作用的路径图
注：黑色加粗线框代表下调的基因。
Figure 6. Pathway of endocytosis participation
Note: The bold black line frame means down regulation of genes after intercropping.
表 1 续断菊单株生物量(mean±SD, n=3)
Table 1 The biomass of S. asper
处理treatment 地上部shoot 地下部root 间作intercropping 2.02±0.15 a 0.53±0.05 a 单作monoculture 1.40±0.11 b 0.43±0.03 b 注：不同字母表示差异显著(P<0.05)；下同。
Note: Different letters indicate significant difference (P<0.05); the same as below.
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表 2 续断菊Cd、Pb转运系数
Table 2 The transport coefficients of S. asper
重金属
heave metal处理
treatment转运系数
the transport
coefficients有效转运系数
the effective
transport coefficientsCd I 1.7 6.5 M 1.5 4.9 Pb I 1.8 6.9 M 0.8 2.7
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表 3 组装结果数据统计
Table 3 Statistic of assembly result
项目items MS-1 MS-2 IS-1 IS-2 原始reads总数量
total number of raw reads39 729 206 38 434 668 37 380 586 40 691 148 过滤后总reads数量(占原始reads总数比例/%)
total number of reads after filter (ratio)39 111 218 (98.44) 37 846 702 (98.47) 36 793 754 (98.43) 40 064 300 (98.46) 原始碱基总长度/bp
total base-pairs4 966 150 750 4 804 333 500 4 672 573 250 5 086 393 500 过滤后碱基总长度/bp
total base-pairs after filter4 888 902 250 4 730 837 750 4 599 219 250 5 008 037 500 样品表达的基因数目(占基因总数比例/%)
genes number (ratio)51 360 (78.58) 48 493 (74.2) 46 090 (70.52) 48 784 (74.64)
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表 4 间作处理差异基因的Pathway显著性富集分析
Table 4 Pathway significant enrichment analysis of differential gene of intercropping
路径编号
pathway ID路径
pathway差异基因
DEGs with pathway
annotation (25)全部基因
all genes with pathway
annotation (10 365)P值
P valueko00780 生物素代谢
biotin metabolism2(8%) 50(0.48%) 0.006 ko00190 氧化磷酸化
oxidative phosphorylation4(16%) 375(3.63%) 0.012 ko04140 自噬调控
regulation of autophagy2(8%) 86(0.83%) 0.018 ko01040 不饱和脂肪酸生物合成(无图)
biosynthesis of unsaturated fatty acids (no map in kegg database)2(8%) 105(1.01%) 0.026 ko00520 氨基糖与核苷酸糖代谢
amino sugar and nucleotide sugar metabolism3(12%) 283(2.73%) 0.030 ko04144 内吞作用
endocytosis2(8%) 413(3.98%) 0.263
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表 5 调控内吞作用的差异基因表达
Table 5 Differentially expressed genes of endocytosis
差异表达基因
differentially expressed genes单作表达量
MSR _rpkm间作表达量
ISR _rpkm差异倍数
log2Ratio (ISR/MSR)P值
P valueFDR检验的P值
FDR显著性
significance基因描述
descriptionUnigene0003926 2.217 0.001 −11.11 6.50E−05 0.027 6 yes ADP核糖基化因1 [蓝藻]
ADP-ribosylation factor 1 [Monoraphidium neglectum]Unigene0030401 1.665 0.001 −10.70 5.24E−07 0.001 0 yes 预测：热激蛋白70 [青梅]
predicted: heat shock 70 ku protein [Prunus mume]
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