3种试剂盒提取烤后烟叶DNA的效果比较
Comparison of the DNA Extraction Effects of Tree Kits on the Tobacco after Baking
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Keywords:
- tobacco after baking /
- kit /
- quantitative real-time PCR /
- gel electrophoresis
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中国是世界上烟叶出口量较多的国家之一，出口产品覆盖全球70多个国家和地区，在国际市场的地位日趋重要[1]。贵州是国内的烟叶生产、销售以及出口贸易的重点省之一[2]。随着科技的快速发展，转基因技术的日渐成熟，烟草作为模式植物被大量研究。虽然转基因技术在提高作物产量和改善品质等方面有着巨大贡献，但其安全性值令人担忧。2001年以来，随着国务院对农业转基因作物及其产品实行安全评价制度、生产许可制度、经营许可制度和产品标识制度，海关更是加大力度对出口烟草的检查[3]。正因如此，对转基因烟叶进行检测和评价是一个重要工作，而在检测的过程中DNA的提取是工作的关键。提取DNA的方法有很多，目前使用较多的是试剂盒提取法，市面上可供选择的DNA提取试剂盒种类较多，不同试剂盒的提取效果及速度等都存在较大差异[4]。因此，本研究对3种DNA提取试剂盒提取烤后烟叶DNA的纯度、浓度和质量等指标的比较，以便筛选出适用于烤后烟叶DNA提取的试剂盒。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试烤后烟叶
来源于贵州省黔东南州镇远县羊场地区烤后烟叶。
1.1.2 供试DNA提取试剂盒
烤后烟叶基因组DNA提取的试剂盒有3种。1号试剂盒：AxyPrep基因组DNA小量试剂盒[康宁生命科学(吴江)有限公司]；2号试剂盒：磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒(长春市志昂生物科技有限公司)；3号试剂盒：GenePure新型植物基因组DNA快速提取试剂盒(Aid lad生物科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
选择同一批的烤后烟叶，提取样品量为100 mg，将其研磨成粉末状后，直接用于3种不同DNA提取试剂盒提取烤后烟叶DNA，按照试剂盒说明书操作。DNA样品短期于−4 ℃保存，长期于−20 ℃保存。
1.2.2 DNA浓度和纯度测定[5]
取2 μL 3种不同试剂盒提取的烤后烟叶DNA用超微量分光光度计(美国Thermo公司，nanodrop2000)检测，读取DNA质量浓度和OD260/OD280比值，重复3次取平均值进行比较。DNA质量浓度高于100 ng/μL为合格样品；OD260/OD280比值大于1.8，低于2.0为纯净样品[6]。提取时间为3种不同试剂盒提取烤后烟叶DNA实际耗费的时间。
1.2.3 实时荧光定量PCR
取2 μL烤后烟叶DNA为模板，采用实时荧光定量PCR系统仪(ViiA7、美国Life technologies)对烟草内源硝酸还原酶基因(NR)进行定性PCR扩增。设计并合成NR基因特异性引物[7]：正向Pf为5′-CCGGAGGCGGTGGTTCAAAGTA-3′，Tm75.3 ℃，266 bp；反向Pr为5′-AAGTTCAGCATCAACATGGGGTGG-3′，Tm73.6，266 bp。
20 μL的PCR反应体系：10×Buffer 2 μL，d NTPs 1 μL，r Taq 0.2 μL，DNA 1 μL，引物各1 μL，ddH2O 13.85 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s：35个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。
对3种不同试剂盒提取的烤后烟叶DNA检测结果Ct值进行对比，重复3次取平均值。Ct值也称循环阈值，PCR循环的过程中，Ct值是荧光信号开始从本底进入指数增长阶段拐点时所对应的循环次数；在实际的操作过程中，Ct值是每个反应管中荧光信号所达到设定值域的时刻[5]。Ct值与起始模板DNA成反比，Ct值越低表明起始模板较多，则可说明提取的DNA质量较好[8]。
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测
取3种不同DNA试剂盒所提取的烤后烟叶DNA 5 μL，在1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳条件：恒压90电泳30 min，电泳缓冲液为1×TAE，EB染色后在凝胶成像系统上对DNA质量进行观察及拍照[9]。
2. 结果与分析
2.1 3种不同试剂盒所提烤后烟叶DNA的质量浓度及纯度的比较
由表1可知：1号试剂盒所提DNA的质量浓度以及纯度均较高，提取耗时短；2号试剂盒的DNA质量浓度略高于1号试剂盒提取的效果，纯度也较高，但提取时间是1号试剂盒所用时间的2倍；3号试剂盒提取的DNA纯度虽稍高于前两者，提取所用时间最短，但是DNA的质量浓度只有前两种试剂盒提取的1/6左右。
表 1 提取DNA的质量浓度、纯度及提取时间比较(n=16)Table 1. The comparing the purity and mass concentration of DNA, and the extraction time试剂盒kits DNA质量浓度/(ng·μL−1) DNA mass concentration DNA纯度(OD260/OD280) 提取时间/min extraction time 1号 178.67±25.759 A 1.83±0.010 646 a 70 2号 193.17±10.807 A 1.83±0.056 062 a 150 3号 36.88±30.683 B 1.85±0.140 707 a 60 注：同列中小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
Note: In the same columns, different lowercase mean significant difference (P<0.05) and different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).2.2 3种不同试剂盒所提烤后烟叶DNA实时荧光定量PCR的Ct值比较
如表2所示：1号试剂盒的总平均Ct值最小，3号试剂盒的总平均Ct值最大。由此判断，1号试剂盒提取烤后烟叶DNA中所含有的PCR模板最多，则所提的DNA质量最佳，2号试剂盒次之，3号试剂盒较差。
表 2 3种试剂盒提取DNA荧光定量PCR扩增Ct值比较Table 2. The comparing quantitative real-time PCR of Ct试剂盒
kits重复3次PCR的Ct值
PCR of Ct repeat 3 times总平均Ct值
total average PCR of Ct1号 22.655 22.38 22.945 21.679 2号 23.098 22.93 22.520 23.172 3号 23.343 23.40 23.331 23.562 2.3 3种基因组DNA提取试剂盒提取烤后烟叶DNA的凝胶电泳图谱的比较
如图1所示：3种试剂盒在15 000 bp处均有DNA条带，说明都能提取出烤后烟叶DNA。
其中，图A、图B的中a、b、c的3个重复的条带都显示最亮，说明1、2号试剂盒提取的DNA质量最好，图C中的3个重复的条带不及图A、图B的条带明显，说明3号试剂盒提取的DNA质量较差。
综上所述，电泳图谱的结果与超微量分光光度计检测的DNA质量浓度的结果、实时荧光定量PCR的Ct值的结果一致，均表明1号和2号试剂盒提取烤后烟叶DNA的质量比3号试剂盒提取的烤后烟叶DNA好。
3种试剂盒所提DNA均有降解现象，这是因为烤后烟叶在烘烤过程中经过高温烘烤，DNA有所降解。
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图 1 3种不同试剂盒提取烤后烟叶DNA凝胶电泳图谱注：A、B、C是3种试剂盒提取的DNA电泳图；a、b、c表示3个重复。Figure 1. The DNA gel electrophoresis of 3 kinds of the tobacco after bakingNote: A, B and C express the DNA gel electrophoresis of 3 kinds of the tobacco after baking; a, b and c express 3 repeats.3. 讨论
本研究以烤后烟叶为试验材料，选择常见的3种不同试剂盒提取基因组DNA，通过比较DNA质量浓度和纯度、实时荧光定量PCR的Ct值以及凝胶电泳条带，结果表明AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取烤后烟叶DNA，能够达到简单、快速及高效的标准。
在研究植物分子生物学或者应用基因组DNA的过程中，其基础是获得高品质的DNA[10]，提取的DNA的质量将会直接影响后续试验结果的准确性，因此选择出适合烤后烟叶基因组DNA提取的方法尤为重要。传统的提取植物基因组DNA的方法主要有CTAB法和SDS法等，但这些方法烦琐且耗时[11]。近年来各种商业化的提取DNA试剂盒被广泛应用，可供来源不同的样品提取，普遍认为试剂盒提取DNA的优点是：操作简便、快速且产量及纯度都较高，方便携带，易于保存[12]，是许多研究者的首选方法。
近年全球反吸烟运动的不断发展以及一些媒体的不实宣传报道，转基因烟草比其他转基因植物更加难以获得消费者认可，因此就要求烟叶出售方确保不能含有转基因成分[13]。由于转基因烟草技术的不断发展及广泛的应用，国家对转基因烟草的检测十分严格。为不影响烟草上市销售或出口，对检测转基因烟草人员的工作效率提出了更高的要求。目前，用于烟草DNA提取的试剂盒类型多样，不同商家的生产质量也存在着较大差异。因此，在检测和评价转基因烟叶工作中，筛选出一种快速、简单和高效的基因组DNA提取试剂盒是非常有意义的。
本研究筛选出的AxyPrep基因组DNA小量试剂盒，采用的是裂解和消化蛋白酶K这一独特的技术，并且在试验中结合使用了DNA制备膜的选择性吸附DNA的方法，使其能达到纯化所提取的基因组的DNA的目的。每次制备可获得多至20 μL的基因组DNA，是一种快速、简短、高效的提取基因组DNA的方法，常用于PCR、Southern印迹分析、RAPD、RFLD等分子生物学实验[14]，能够适用于快速的提取少量烤后烟叶基因组DNA，并且DNA质量较高。
目前关于研究筛选适用于烤后烟叶基因组DNA提取试剂盒的相关报道比较少。扩大供试烤后烟叶的材料和试剂盒范围的试验将有待进一步的研究。
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图 1 3种不同试剂盒提取烤后烟叶DNA凝胶电泳图谱
注：A、B、C是3种试剂盒提取的DNA电泳图；a、b、c表示3个重复。
Figure 1. The DNA gel electrophoresis of 3 kinds of the tobacco after baking
Note: A, B and C express the DNA gel electrophoresis of 3 kinds of the tobacco after baking; a, b and c express 3 repeats.
表 1 提取DNA的质量浓度、纯度及提取时间比较(n=16)
Table 1 The comparing the purity and mass concentration of DNA, and the extraction time
试剂盒kits DNA质量浓度/(ng·μL−1) DNA mass concentration DNA纯度(OD260/OD280) 提取时间/min extraction time 1号 178.67±25.759 A 1.83±0.010 646 a 70 2号 193.17±10.807 A 1.83±0.056 062 a 150 3号 36.88±30.683 B 1.85±0.140 707 a 60 注：同列中小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
Note: In the same columns, different lowercase mean significant difference (P<0.05) and different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).
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表 2 3种试剂盒提取DNA荧光定量PCR扩增Ct值比较
Table 2 The comparing quantitative real-time PCR of Ct
试剂盒
kits重复3次PCR的Ct值
PCR of Ct repeat 3 times总平均Ct值
total average PCR of Ct1号 22.655 22.38 22.945 21.679 2号 23.098 22.93 22.520 23.172 3号 23.343 23.40 23.331 23.562
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百度学术
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