血型是动物的一种不受外界因素影响的遗传性状，是根据血液中存在抗原的不同进行分类，并以血液抗原形式表现出来，不同的遗传因子决定着不同的血型。广义的血型泛指动物血液中的红细胞、白细胞、血小板以及某些血浆蛋白在个体间存在的抗原差异，狭义的血型仅指血液红细胞抗原在个体间的差异^[1]。在医学和现实生活中，通常说的血型是指红细胞血型，红细胞血型抗原是一类糖蛋白，具有免疫学特性，抗原特异性由糖蛋白的糖基结构决定，由于决定红细胞表面抗原的糖基不同，血液被分成若干血型(blood group)。1900年奥地利学者应用红细胞凝集试验首次发现了人的ABO血型系统，这也是如今最常见的血型系统，含有两种抗原(A抗原和B抗原)，分为A、B、AB、O四型；其次为Rh血型系统，主要分为Rh阳性和Rh阴性；再次为MN及MNSs血型系统。目前，已发现人类红细胞血型系统有30多种，猪有16种，由于猪的红细胞ABO血型系统自身没有B抗原，所以猪没有B型血，只有A型血和O型血，因此称为AO血型系统。以往人们对血型的了解仅局限于医院临床输血、司法亲子鉴定方面，实际上，血型在人种演化研究、疾病关联分析、司法机关破案、组织器官移植配型等方面都有广泛的实用价值^[2]，因此具有重要的理论和实践意义。

猪血型的研究已有近70年的历史，但发展较为缓慢，开展的研究主要集中在血型类别与肉质、生产性能相关规律性的探索，以及作为个体、品种(系)的遗传标记，用于系谱登记、亲子鉴别、追溯品种起源、演变、品种亲缘关系检查等，对动物育种实践及其发展起到一定的促进作用^[3]。随着分子生物学的快速发展，猪的血型研究已从抗血清的制备、分型和命名阶段转向更为准确的血型抗原的基因分型研究，并已开展了血型遗传基因和蛋白多态性与猪品种、品系的起源分化及其遗传变异关系的研究^[4]。近年来，血型研究的重点主要集中在异种器官移植、异种输血的研究方面，由于猪的解剖、生理与人相似，且具有数量多、易繁殖、综合费用低等优点，较其他动物更适合作为异种移植的器官供体^[5-6]。版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line，BMI)经过连续20多代的高度近交，具有遗传背景清楚、基因高度纯合、实验可重复性高等特点，是异种器官移植、基因敲除、生物医学实验等研究最理想的实验动物，在生命科学领域中具有极其重要的潜在价值^[7-8]。因此，对版纳微型猪近交系的AO血型A基因进行研究，具有现实的意义。

1.   材料与方法

1.1   材料

样品采自云南农业大学版纳微型猪近交系重点实验室实验猪场，选择以人用血清学抗A、抗B试剂检测均为A血型的3头成年版纳微型猪近交系，屠宰后取心、肝、脾、肺、肾、胰、肌肉、皮肤、大脑、小脑、大肠、小肠、肾上腺、颌下腺、脑垂体组织，液氮速冻，−80 ℃超低温冰箱保存。采集过程的器皿均经过无RNA酶处理，确保采集过程中样本不被RNA酶降解。

1.2   RNA的提取和cDNA的制备

提取样本总RNA的TransZol up试剂盒和反转录试剂盒均购自TransGen Biotech公司，参照说明书提取样本的总RNA并反转录得到cDNA，将每头猪的15个组织cDNA各取2 μL混合为1个cDNA混合池，以此为模板进行扩增。

1.3   引物设计

参考登录号为AF050177和NM_213799的两条猪的全基因序列设计并合成两对引物，引物F1：5′-TGACCTCCACCCCCATCCCTG-3′，引物R1：5′-GATATGTCCTGCCAGCGACT-3′，扩增产物涵盖AO血型A基因第1至第7外显子和部分第八外显子，片段长度为649 bp；引物F2：5′-CAACTACTACATCTTCACCGACC-3′，引物R2：5′-CAATTCTTTCCGCGCCTGT-3′，用于扩增AO血型A基因部分第8外显子，片段长度为700 bp。

1.4   PCR产物扩增、克隆和测序

PCR扩增的反应体系为：Premix Taq (TransGen Biotech公司) 26.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2.0 μL，cDNA模板3.0 μL，ddH₂O 17.0 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，退火30 s[(退火温度F1/R1为61 ℃，F2/R2为58 ℃)]，72 ℃ 30 s，35个循环，最后72 ℃延伸7 min。

PCR产物纯化回收：用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶试剂盒，按照试剂盒说明书操作步骤纯化回收PCR产物。

克隆和测序：将回收产物连接到载体pMD18-T (TaKaRa公司)，转化大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ (TaKaRa公司)，将菌液均匀涂抹于含有Amp、X-Gal和IPTG的LB平板培养基上，于37 ℃培养箱中培养过夜；挑白色单菌落接种于4 mL的LB培养液中培养至浑浊，PCR检测菌液阳性后，部分菌液进行双向测序(硕擎生物科技公司)。

1.5   生物信息学分析

使用Lasergene、BioEdit、DNAMAN软件对测序所得的AO血型A基因序列进行拼接、比对和人工校对，用Generunr软件预测出开放阅读框，并与NCBI (National Center for Biotechnology Information)中所公布的与其核苷酸编码区序列和相应氨基酸序列相似性较大的猪、牦牛、藏羚羊、水牛、小须鲸、绵羊、羊驼、野骆驼、山羊、黑猩猩、人、小鼠12个物种进行相似性比较并构建系统进化树。用在线分析软件ExPaSy PrtPrama分析AO血型A基因编码蛋白质的结构，通过SignalP 4.1 Server、NetNGlyc 1.0 Server、NetOGlyc 4.0 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM Server v.2.0分别预测蛋白信号肽序列、N-糖基化位点、O-糖基化位点、磷酸化位点和跨膜结构域。利用SOPMA方法和Swiss-model软件预测蛋白质的二级结构和三级结构。

2.   结果与分析

2.1   AO血型A基因的扩增结果

以反转录后得到的cDNA混合池为模板进行PCR扩增，结果显示：用设计合成的两对引物扩增的3头版纳微型猪近交系猪的AO血型A基因均有特异性扩增条带，特异性片段分别为649、700 bp，与预期扩增片段大小一致(图1)。

图  1  版纳微型猪近交系猪AO血型A基因PCR扩增电泳图

注：M. DL2000 Marker；1~3. F1/R1引物对扩增的DNA片段；4~6. F2/R2引物对扩增的DNA片段。

Figure  1.  Electrophoretogram of PCR amplification on AO blood group A gene of Banna mini-pig inbred line

Note: M. DL2000 Marker；1-3. The fragment is amplified by F1/R1；4-6. The fragment is amplified by F2/R2.

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2.2   AO血型A基因核苷酸序列比对及系统进化树

用DNA分析软件将获得的核苷酸序列进行拼接、整理和比对，3头猪的AO血型A基因核苷酸序列完全相同。将获得的序列输入到NCBI的GenBank中分别在核苷酸和氨基酸水平进行Blast比对，版纳微型猪近交系AO血型A基因与存在于数据库中其他12种动物的血型基因在核苷酸和氨基酸水平上均有着较高的相似性(图2、3)。该基因在核苷酸水平与数据库中的其他猪、牦牛、藏羚羊、水牛、小须鲸、绵羊、羊驼、野骆驼、山羊、黑猩猩、人、小鼠的序列相似性分别为99.6%、83.7%、85.2%、83.6%、85.4%、83.3%、84.8%、84.3%、88.2%、62.8%、63.8%、63.0%。

图  2  BMI与12个物种间AO血型A基因编码蛋白质的核苷酸序列比对

Figure  2.  Alignment of nucleotide sequences of coding region of AO blood group A gene between BMI and other 12 species

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图  3  AO血型A基因核苷酸序列系统进化树

Figure  3.  Molecular phylogenetic tree of AO blood group A gene nucleotide

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2.3   AO血型A蛋白的结构分析

版纳微型猪近交系AO血型A基因编码蛋白结构预测结果显示该蛋白分子量为42.357 ku，理论等电点为7.18。在氨基酸组成上，酸性氨基酸(Asp+Glu)有41个，碱性氨基酸(Lys+Arg)有41个；其中异亮氨酸(Leu)占9.9%，缬氨酸(Val)占8.8%，脯氨酸(Pro)占7.4%，精氨酸(Arg)占6.9%，苯丙氨酸(Phe)占6.0%，含量较高。蛋白质不稳定指数为57.83，属于不稳定蛋白；脂溶指数为84.84，总的亲水性平均系数(grand average of hydropathicity，GRAVY)为–0.234。AO血型A蛋白没有信号肽位点(图4)；含有3个N-糖基化位点分别在第123、187和204位氨基酸处(图5)，3个O-糖基化位点分别在第43、45和55位氨基酸处。

图  4  AO血型A蛋白的信号肽位点

Figure  4.  The signal peptide of AO blood group A protein

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图  5  AO血型A蛋白的N-糖基化位点

Figure  5.  The N-glycosylation site of AO blood group A protein

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AO血型A蛋白磷酸化位点预测显示存在32个磷酸化位点，其中丝氨酸(Ser)磷酸化位点14个、苏氨酸(Thr)磷酸化位点12个、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点6个(图6)。

图  6  AO血型A蛋白氨基酸磷酸化位点

Figure  6.  The amino-acid phosphorylation site of AO blood group A protein

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通过Expasy软件中的TMHMM Server v.2.0工具预测AO血型A蛋白的跨膜螺旋区(图7)。预测结果显示：AO血型A蛋白氨基酸序列中存在跨膜螺旋区，蛋白质的氨基酸残基1~12在胞内，13~35跨膜，36~364在胞外，为跨膜蛋白。

图  7  AO血型A蛋白跨膜结构域

Figure  7.  The transmembrane structures domain of AO blood group A protein

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ExPASy-ProtScale程序预测蛋白质的疏水性，Ｎ末端和Ｃ末端都亲水，在氨基酸的第22位置有最大疏水值2.978，在氨基酸的第40位置有最小疏水值−2.556 (图8)。

图  8  AO血型A蛋白质疏水性分析

Figure  8.  Hydropathy analysis result of AO blood group A protein

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预测的AO血型A蛋白的二级结构显示：参与α-螺旋的氨基酸有105个，含量达到28.85%；有82个氨基酸参与延伸链，占22.53%；28个氨基酸可能参与β-转角，占7.69%；149个氨基酸可能参与无规则卷曲，占40.93%。以上分析可以推测，无规则卷曲是AO血型A蛋白的主要结构(图9)。

图  9  AO血型A蛋白的二级结构

注：无规则卷曲、β-转角、α-螺旋和延伸链结构分别用最短、次短、次长和最长的竖线表示。

Figure  9.  The secondary structure of the AO blood group A protein

Note: The random coils, beta turns, alpha helices and extended strand is the shortest, the second shortest, the second longest and the longest vertical lines, respectively.

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用Swiss-model程序对AO血型A蛋白进行相似建模，版纳微型猪近交系AO血型A蛋白的76~364位氨基酸序列与人4y62蛋白^[9]的相似度为64.08%，比对氨基酸覆盖度为79.40% (图10)。

图  10  AO血型A蛋白的三级结构

Figure  10.  Tertiary structure of AO blood group A protein

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3.   讨论

血型是动物的一种遗传性状，具有稳定的遗传性和高度的特异性。ABO血型的分型是根据红细胞表面抗原的种类来划分的^[10]。ABO血型抗原决定簇是一种特异性多糖，糖基转移酶控制着糖链的形成^[11-12]。ABO血型抗原有共同的前身物H物质，H物质最后的1个糖基决定ABO/ABH血型的型别。A型个体能产生具有活性的a-N-乙酰-D-半乳糖胺转移酶(A型转移酶)，它可将底物(UDP-NAeGa1)上1分子的N-乙酰-D-半乳糖氨基(NAcGa1)转移到H物质上形成A抗原；B型个体能产生具有活性的a-D-半乳糖转移酶(B型转移酶)，它可将1分子的a-D-半乳糖基(Ca1)转移到H物质上形成B抗原。O型个体不能产生具有活性的A型或B型转移酶，所以只能产生H抗原^[13]。AB型个体能同时产生具有活性的A型转移酶和B型转移酶，所以在他们的红细胞上能形成A、B两种抗原。因此，ABO血型表型是由各自特异的糖基转移酶基因所控制和决定的。人类ABO基因位于9号染色体，A、B基因并不是直接产生A、B抗原，而是分别编码353个氨基酸组成的α(1,3)N-乙酰氨基半乳糖胺转移酶和D-半乳糖转移酶来生产A、B抗原，人类ABO基因的编码长1 065 bp，包含7个外显子^[14]。猪的ABO基因位于1号染色体，编码长1 095 bp，包含8个外显子，由于猪没有B基因，只有A和O两个等位基因，所以只有A型血和O型血^[15]。相对于人的ABO血型系统，猪的血型系统被称为AO血型系统^[16]。

本研究则通过RT-PCR、克隆测序获得了版纳微型猪近交系3头猪的糖基转移酶A基因编码区全序列，结果表明：所扩增的基因序列中包含1个由1 095 bp碱基组成的完整ORF，编码364个氨基酸，ATG和TGA碱基分别为ORF的起始和终止密码子，扩增、克隆测序得到的序列与GenBank中搜索到的其他猪的结果一致。与人的同一基因序列相比较，猪的ORF序列比人的少30个碱基，但猪的第8外显子与人的第7外显子的片段长度一致，均为691 bp，与其他物种间也具有很高的相似性。

将版纳微型猪近交系的糖基转移酶A基因核苷酸序列与GenBank中其他猪比对(序列号分别为AF050177、NM_213799)，其相似性均别为99.6%，有4个位点有突变，分别是109(A/G)、438(G/A)、609(A/C)、801(A/G)，除109位核苷酸的错义突变导致了对应氨基酸37(R/G)发生改变外，其他3个均为同义突变。与同是偶蹄目动物的牛、羊和海洋哺乳动物小须鲸在基因水平相似性较高，都在82%以上。构建的多物种系统进化树显示了版纳微型猪近交系的红细胞血型A基因与偶蹄目动物和海洋哺乳动物小须鲸聚为一类，与羊驼、野骆驼较为相近，与人、黑猩猩、小鼠相距甚远。采用生物信息学分析软件预测的版纳微型猪近交系AO血型基因编码蛋白没有信号肽，属于不稳定的脂溶性蛋白，存在着较多的磷酸化位点，这些磷酸化位点可能对修饰AO血型糖基转移酶的蛋白活性起着重要作用。

通过对版纳微型猪近交系AO血型A基因的编码序列分析发现，猪与人的氨基酸同源性仅有63.8%，直接将猪作为人体器官异种移植的供体动物似乎还很遥远，因为在最基本的血型配型上就很难实现，但随着生物技术和医学的不断发展，可通过基因编辑技术和育种选育的方式来获得具有人源化特定基因并适合于异种移植的供体猪。