秸秆作为一种优质的生物质能，产沼气潜力巨大。在沼气工业最为发达的德国，大量采用秸秆作发酵原料是其沼气产业迅猛发展的主要因素^[1]。沼气的生产方式分为湿法厌氧发酵和干法厌氧发酵，其中干式厌氧发酵又称为固体厌氧发酵或高浓度厌氧发酵，是总含固率(total solid, TS)高于15%的发酵技术^[2]。研究显示：虽然湿式厌氧发酵系统的启动速度高于干式厌氧发酵系统，但是两者物料能源转化率基本持平，而在相同负载的情况下，干式厌氧装置的体积仅为湿式厌氧装置的1/2^[3]。因此，与传统湿式发酵相比，干式发酵具有节水、污染小、管理方便、成本低等优点，逐渐成为国内外沼气行业的重要发展趋势^[4]。

木质纤维素类成分的水解是厌氧发酵产沼气的限速步骤^[5]。秸秆类物料中的纤维素、半纤维素和木质素交织在一起，形成了复杂的结构，限制了纤维素原料的降解，成为纤维素原料在沼气厌氧发酵中应用的一大瓶颈^[6]。尤其是在干式厌氧发酵中，粗纤维之间的交联导致水解阶段难以完成，造成启动缓慢，甚至无法启动。多项研究显示：通过对原料进行预处理能够有效断裂半纤维素和木质素的氢键，破坏物料保护层，降低纤维素的聚合度和结晶度，使其易于降解^[7-9]。就目前而言，预处理方法包括物理法、化学法、生物法以及它们之间联合利用。其中，生物法主要采用各类真菌、酶进行原料预处理，因反应条件温和、处理成本低、处理过程对环境影响小而逐渐被重视^[10-12]。

能源植物杂交狼尾草(Pennisetum americanum × P. purpureum)是以象草为父本，一年生美洲狼尾草为母本的杂交种，产量高、生长快，研究显示其原料TS产气率较高，达到了525 mL/g，作为厌氧发酵的发酵原料具有先天的优越性^[13]。杂交狼尾草成分中纤维素含量约为45.5%，木质素含量约为8.93%^[7]，较高的木质纤维素含量直接导致其在湿式厌氧发酵中能够快速启动，而在物料TS增加后，启动时间大幅度推迟。课题组在前期干式发酵预实验中也发现：对杂交狼尾草不做预处理的情况下，TS为15%时系统启动需要20 d以上，而当TS达到20%时，系统启动困难。

如何提升杂交狼尾草中纤维素类成分的降解速度将直接影响其在厌氧发酵产沼气中的应用^[14]。本研究采用多种真菌和酶对杂交狼尾草原料进行预处理，探讨不同处理方式对杂交狼尾草干式厌氧发酵产气过程的影响，进而寻找能够促进杂交狼尾草快速降解及能源转化的生物预处理条件，为其在生产上的实际应用提供依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料及设备

杂交狼尾草原料：为自种杂交狼尾草的地上部分(2012年5月播种于云南农业大学后山，2015年3月采收)。采收后的杂交狼尾草于通风阴凉处自然晾干，切分为2~3 cm段，常温密封保存。其总固体(total solid，TS)含量为91%，总挥发物(volatile solide，VS)为81%。

接种用污泥：于2016年3月采自昆明市第五水质净化厂的脱水污泥，泥体呈黑褐色，其TS含量为17%，VS含量为7%，用前驯化。测得驯化好的污泥TS含量为6.6%，VS含量为4%。

糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、香菇(Lentinus edodes)子实体于2015年12月购于昆明市蒜村菜市场；长根菇(Oudemansiella radicata)菌丝体由云南农业大学食用菌研究所提供。10 000 U/g漆酶及100 000 U/g纤维素酶均购于湖北远成赛创科技有限公司。

厌氧发酵实验系统：为项目组自制的1 L厌氧发酵装置，主要由DZKW-S-8型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)、发酵罐、集气瓶和集水瓶组成：发酵罐为1 L广口瓶，采用胶塞密封，置于恒温水浴锅中以提供恒温环境，发酵罐口设料液取样口及导气管；导气管连接集气瓶，上设三通阀，方便气样采集。

1.2   试验方法

1.2.1   真菌培养液制备

在28 ℃ DHD-360型电热恒温培养箱(北京市永光明医疗仪器厂)中，固体PDA培养基(成分：葡萄糖20 g，去皮土豆200 g，MgSO₄ 1.5 g，KH₂PO₄ 3 g，Vb₁ 10 mg，加水搅拌混合至1 000 mL，用柠檬酸 0.1 g/L调pH 6.0~6.5)上，进行3种真菌菌丝体的培养、分离及纯化。纯化好的菌丝在相同条件下培养7 d后接种在液体培养基(除不加琼脂外，其他成分与PDA培养基相同)中，于28 ℃ DHZ-CA恒温摇床中(太仓市实验设备厂)，150 r/min转速下，培养10 d，得到培养液。测得糙皮侧耳、香菇、长根菇培养液TS浓度分别为2.25%、2.73%、2.62%。

1.2.2   原料处理

原料处理采用真菌培养液和酶制剂处理(表1)。其中，真菌处理采用预发酵方式进行(A~C组)，酶制剂在厌氧发酵同时直接加入混合物料中(D、E组)。试验同时设置对照I组(加水堆沤)和对照II组(无处理)。喷洒真菌培养液后，平菇菌丝第4天出现在原料表面，第7天布满基质；香菇菌丝第5天开始出现，第9天布满基质；长根菇菌丝第2天开始出现，第5天布满基质。

表  1  杂交狼尾草处理

Table  1.  Treatment of hybrid pennisetum

试验编号 test codes	处理剂 treating agent	用量 amount	水/mL water	预发酵时间/d pre-fermentation time
CK-I	—		200	20
CK-II	—		0	0
A1	糙皮侧耳培养液/mL fermentation broth of P. ostreatus	50	150	20
A2		100	100	20
A3		150	50	20
A4		200	0	20
B1	长根菇培养液/mL fermentation broth of O. radicata	50	150	20
B2		100	100	20
B3		150	50	20
B4		200	0	20
C1	香菇培养 液/mL fermentation broth of L. edodes	50	150	20
C2		100	100	20
C3		150	50	20
C4		200	0	20
D1	纤维素酶 / mg cellulase	25	0	0
D2		50	0	0
D3		100	0	0
D4		200	0	0
E1	漆酶/mg laccase	37.5	0	0
E2		75	0	0
E3		150	0	0
E4		300	0	0
注：表中A~C组用量为处理150 g原料的用量，D和E组用量为250 g混合物料用量。 　　Note. The amounts in test group A-C are used for the treatment of 150 g grass; the amounts in test group D and E are used for the treatment of 250 g mix feeds.

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1.2.3   厌氧发酵试验

试验采用一次性进料方式，在1 L棕色瓶中加入40 g处理后的杂交狼尾草(酶试验直接用阴干后的杂交狼尾草加不同浓度梯度的酶)，接入活性污泥，加水调节总料液质量为250 g，TS浓度为20%，VS接种率为20% (按照接种污泥和杂交狼尾草的VS计算所得)，调节初始pH为7.0，进行90 d发酵。投料后的第2天开始检测产气情况，包括记录日产气量、甲烷浓度、pH。

1.2.4   检测方法

TS质量分数采用DHG-9053A型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)于(105±5) ℃下测定；VS质量分数采用SX2-2.5-10马弗炉(上海实研电炉有限公司)于(550±20) ℃下测定；日产气量采用排水法测定；沼气中甲烷体积分数采用GT901型甲烷测定仪(深圳科尔诺电子科技有限公司)测定；料液pH值用精密pH试纸测定；单位原料干物质产气量(TS产气率)、单位原料挥发性有机物产气量(VS产气率)、日容积产气率均通过公式计算得出。各项目数据均为3次平行测定结果均值，采用Excel进行数据处理及图形绘制。

2.   结果与分析

2.1   糙皮侧耳培养液预处理对厌氧发酵的影响

由图1可知：糙皮侧耳培养液处理的4个试验组(A1~A4)累积产气量分别为13 336、13 816、10 005、9 873 mL，与加水堆沤对照组(对照I)相比较，A1和A2组产气量分别提升了27.65%和32.24%，A3和A4组产气较对照I组略少。与无处理对照组(对照II)相比较，4组产气量分别提升了46.24%、51.50%、9.71%、8.26%，促产气效果显著。分析各试验组产气过程可以发现：对照I组厌氧发酵初期体系出现快速酸化水解，代谢产物以CO₂为主，第10天开始进入产甲烷阶段，第20天才达到产气高峰，产甲烷阶段启动较慢在一定程度上造成了有机质的损失。对照II组原料水解速度较慢，其甲烷阶段的启动时间和产气高峰到达时间与对照I组接近。而4个处理组虽然发酵初期原料水解速度比对照I组慢，但是其产甲烷阶段启动迅速，并提前10 d达到产气高峰。而且两个对照组产气峰值分别为233、190 mL，也明显低于4个处理组的产气峰值(355、400、290、300 mL)。试验中每150 g物料喷撒100 mL培养液处理效果最好，原料TS产气率为379.6 mL/g。各试验组在产气稳定期其甲烷浓度和pH均相差不大。

图  1  糙皮侧耳培养液处理组累积产气量和日产气量

Figure  1.  Accumulated and daily biogas yield of experiment groups treated with P. ostreatus

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2.2   长根菇培养液预处理对厌氧发酵的影响

图2显示：长根菇培养液处理的4个试验组(B1~B4)累积产气量分别为11 985、12 673、12 359、7 879 mL，与加水堆沤对照组(对照I)相比较，B1~B3组产气量有明显增加，分别提升了14.72%、21.30%、18.29%，整体上随着培养液用量的增加，产气量呈现先上升后下降的变化趋势。B4组产气量低于对照组，可能是由于培养液用量太大，导致的有机质过量损失。与对照II组比较，4个处理组产气增量分别为31.42%、38.97%、35.52%、–13.60%。从各试验组产气过程可以看出：长根菇培养液处理组和2个对照组相比其产甲烷阶段启动时间和产气高峰出现时间均比较接近，但产气峰值较高。在产气周期的后半程，B1~B3试验组日产气量明显高于2个对照组。试验中每150 g原料喷洒100 mL培养液处理效果最优，原料TS产气率为348.2 mL/g。各试验组在产气稳定期其甲烷浓度和pH均相差不大。

图  2  长根菇培养液处理组累积产气量

Figure  2.  Accumulated and daily biogas yield of experiment groups treated with O. radicata

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2.3   香菇培养液预处理对厌氧发酵的影响

图3显示：香菇培养液处理的4个试验组(C1~C4)累积产气量分别为13 378、12 657、11 341、12 223 mL，与对照I组相比，产气量分别提升了28.05%、21.15%、8.55%、17.00%。与对照II组相比，产气增量更为显著，分别增加了46.69%、38.79%、24.36%、34.03%。从各试验组产气过程可以看出：香菇培养液处理组的产气高峰的出现时间明显早于2个对照组，各组产气峰值分别也明显高于对照组的产气峰值。其中整体效果最好的C1组产气高峰出现在发酵的第10天，产气峰值达到了390 mL，是对照I组峰值的1.70倍，是对照II组峰值的2.08倍。整体而言，采用不同量香菇培养液对原料进行预处理，均显示了良好的促产气效果，相比较而言，每150 g原料添加50 mL培养液效果最优，原料TS产气率为367.5 mL/g。各实验组在产气稳定期其甲烷浓度和pH则相差不大。

图  3  香菇培养液处理组累积产气量

Figure  3.  Accumulated and daily biogas yield of experiment groups treated with L. edodes

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2.4   纤维素酶处理对厌氧发酵的影响

由图4可知：添加了纤维素酶的4个试验组(D1~D4)累积产气量分别为9 915、11 383、12 823、11 027 mL，与对照II组相比，产气增量明显，分别增加了8.73%、24.82%、40.61%、20.92%。从各试验组产气过程可以看出：添加了纤维素酶的处理组在发酵初期水解速度明显加快，其产气高峰的出现时间明显早于对照组，各组产气峰值也明显高于对照组。整体而言，在发酵体系中添加不同量纤维素酶，均显示了良好的促产气效果，其中D3组(每250 g物料添加100 mg纤维素酶)效果最优，原料TS产气率为352.3 mL/g。各试验组在产气稳定期其甲烷浓度和pH则相差不大。纤维素酶作为一种高活性生物催化剂，能够提高物料中纤维素类成分的降解速度，进而影响整个厌氧发酵过程。系统启动第1天，处理组产气量明显高于对照组(主要成分为二氧化碳)，显示适量纤维素酶的添加有助于物料的快速降解。但是过量纤维素酶的添加由于初期物料酸化过度，不仅会造成有机质损失，而且在一定程度上抑制了甲烷化的进行，因而导致产气效率变差。

图  4  纤维素酶处理组累积产气量

Figure  4.  Accumulated and daily biogas yield of experiment groups treated with cellulases

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2.5   漆酶处理对厌氧发酵的影响

图5所示：添加了漆酶的4个试验组(E1-E4)累积产气量均高于对照II组，分别为11136、11617、10963、11247 mL。与对照II组相比，产气量分别增加了22.11%、28.04%、20.21%、23.33%，但各处理组之间差异不明显。从各组产气过程可以看出：漆酶的添加同样能够加速原料水解速度，但整体而言与对照组产气过程变化趋势基本一致。效果最优的为E2试验组(每250 g物料添加75 mg纤维素酶)，原料TS产气率为319.1 mL/g。各试验组在产气稳定期其甲烷浓度和pH同样差异不大。

图  5  漆酶处理组累积产气量

Figure  5.  Accumulated and daily biogas yield of experiment groups treated with laccase

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3.   讨论

未经预处理的秸秆类原料进行厌氧消化时存在消化率低、产气量少、产气启动时间长等问题，在干式发酵中系统更是由于TS较高而难于启动，这已经成为秸秆厌氧发酵产生沼气的瓶颈。对秸秆类原料进行预处理能够有效解决由于木质素阻滞而造成的秸秆厌氧发酵转化率低的问题。而相对于化学和物理方法，生物法在预处理成本、设备以及对环境安全等方面都具有独特的优势。

木质素的完全生物降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果，其中真菌起着主要作用。某些真菌对木质素及其衍生物具有独特的降解能力和机制，尤其是白腐菌，能够通过分泌木质素过氧化物酶系、锰过氧化物酶系、漆酶及过氧化氢酶等将木质素降解为小分子物质。整体而言，木质纤维素的降解率同真菌培养液添加量呈线性关系，但同产气量并不呈线性关系，而是有个产气量最佳值^[15]。并且，真菌接种后的前期主要利用物料中的糖类等可溶性小分子物质、纤维素和半纤维素提供自身生长和对木质素进行降解，之后才进行木质素的降解^[16]，因此，采用真菌对原料进行预降解要保证足够的处理时间。此外，不同真菌其生长速度及生长条件并不相同，其较优的处理条件仍然需要进一步系统研究。

糙皮侧耳和香菇都属于白腐菌，其预处理的促产气作用主要是由于能够有效降解原料中的木质素，破坏秸秆表面的致密结构，从而加速有机质厌氧发酵过程中的转化。已有研究显示：糙皮侧耳能够有效降解玉米秸秆，并且随着处理时间的延长其表面空洞增多、增大，形成近似网状结构，结构变化明显，并且这种变化与秸秆中木质素含量测定的结果相一致^[16]。香菇中分解木质素的基因总数高于其他真菌，有着极强的降解木质纤维素的潜在能力^[17]，而且木质素在香菇生长的前期降解速度较快，能够有效促进纤维素和半纤维素的进一步分解^[18]。本研究采用上述2种白腐菌对杂交狼尾草进行预处理，均收到了良好效果，厌氧发酵过程中的原料降解速度和沼气转化率都得到了一定程度的提升。但是需要注意控制培养液用量，采用大量培养液进行原料预处理虽然可以提高木质纤维素降解率，但同时也会过多消耗后续厌氧发酵微生物用于分解的有机物，反而造成产气量减少。

以往采用真菌对木质纤维素进行降解的研究主要集中于白腐菌，本研究将长根菇应用于物料预处理也获得了良好的效果。长根菇又称长根奥德蘑、长根金钱菌，属于木腐菌的一种^[19]，其生长基质主要以富含木质素和纤维素的农作物副产品为主，如稻草、木屑、玉米秆、玉米芯、甘蔗叶、甘蔗渣等，能够通过分泌木质素降解酶及辅助酶系降解木质素。其菌丝生长温度12～35 ℃，子实体发育温度15～28 ℃，比较适于云南地区种植，且其菌丝蔓延迅速、抗逆性强，产量高，栽培技术简便，易于推广应用^[20]。因此，在沼气原料生物预处理菌种的筛选过程中要进一步拓宽思路。

在物料中添加酶是常用的原料预处理方法之一。研究表明：纤维素酶的最佳活性条件是温度介于40~50 ℃，酸性纤维素酶最适酶促反应pH为4.8左右，中性纤维素酶能在较广的pH范围内使用，最适pH为5.0~7.5，而碱性纤维素酶最适酶促反应pH 8.5~9.5^[21]。上述条件与厌氧发酵适宜条件并不完全符合，虽然本试验中纤维素酶的应用也能明显提高杂交狼尾草的产气率，但其作为辅助添加剂或在两相式发酵中可能会展现更好的促降解作用。漆酶最早分离自漆树渗出物，在自然界的分布最为广泛。漆酶同时具有催化解聚和聚合木质素的作用，一般认为在锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶等其他酶存在时，漆酶才具有较高的木质素降解效率^[22]。本试验显示：漆酶单独作用下也能够有效促进木质素的降解，该结果与李晓等^[23]的研究一致，但不排除在同时添加其他酶时降解效果会更突出。关于酶的添加方法及组合方式应该开展更加系统深入的研究。

4.   结论

(1)采用真菌和酶对杂交狼尾草进行生物预处理，均能够明显提升厌氧发酵产沼气量。3种真菌最优处理用量(按150 g原料算)分别为：糙皮侧耳培养液(100 mL)、长根菇培养液(100 mL)、香菇培养液(50 mL)；2种酶最优处理用量(按250 g混合物料算)分别为：纤维素酶(100 mg)、漆酶(75 mg)。上述5种处理条件下，系统产气量比无处理对照组分别提高了51.50%，38.97%，46.69%，40.61%，28.04%。

(2) 5种处理方法平均产气量从高到低的顺序为：香菇培养液处理(12 400 mL)>糙皮侧耳培养液处理(11 758 mL)>纤维素酶处理(11 287 mL)≈漆酶处理(11 255 mL)≈长根菇培养液处理(11 224 mL)>水堆沤(10 447 mL)>无处理(9 119 mL)。整体而言，两种白腐菌的促产气效果最优，两种酶和长根菇促产气效果其次，加水堆沤效果再次，均明显优于无处理组。而相对于酶的应用，采用真菌进行原料预处理对环境条件的要求相对温和，常温即可进行，因此优势明显，有更好的应用前景。