云南农业大学学报(自然科学)
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云南农业大学学报(自然科学) 2012, Vol. 27 Issue (6) :820-825    DOI: 10.3969/j.is.1004-390X(n).2012.06.009
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绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达
霍海龙1,2, 赵跃1, 王锐1, 侯慧芳3, 李卫真4, 张永云5, 刘丽仙1, 王配4, 霍金龙4
1. 云南农业职业技术学院畜牧兽医系, 云南昆明650031;
2. 云南大学生命科学学院, 云南昆明650091;
3. 忻州市农业机械管理局山西忻州034000;
4. 云南农业大学动物科学技术学院, 云南昆明650201;
5. 云南农业大学农科专业基础实验教学示范中心, 云南昆明650201
Construction of Prokaryotic Expression Plasmid pET32a-AcGFPl of Green Fluorescent Protein and Their High Efficient Expression in Escherichia Coli
HUO Hai-long1,2, ZHAO Yue1, WANG Rui1, Hou Hui-fang3, LI Wei-zhen4, ZHANG Yong-yun5, LIU Li-xian1, WANG Pei4, HUO Jin-long4
1. Department of Husbandry and Veterinary, Yunnan Vocational and Technical College of Agriculture, Kunming 650031, China;
2. Faculty of Life Science, Yunnan University, Kunming 650091, China;
3. Bureau of Agricultural Machinery Administration of Xinzhou City, Xinzhou 034000, China;
4. College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;
5. Teaching Demonstration Center of the Basic Experiments of Agricultural Majors, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

摘要
参考文献
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摘要 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a-AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES-AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a(+)构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达绿色荧光蛋白,经15%SDS-PAGE鉴定,结果显示:重组质粒pET32a-AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES-AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a-AcGFP1转化Rosetta(DE3),经不同浓度的IPTG诱导,SDS-PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+)-TAT-AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。
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关键词绿色荧光蛋白   基因克隆   报告基因   原核表达     
Abstract: 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a-AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES-AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a(+)构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达绿色荧光蛋白,经15%SDS-PAGE鉴定,结果显示:重组质粒pET32a-AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES-AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a-AcGFP1转化Rosetta(DE3),经不同浓度的IPTG诱导,SDS-PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+)-TAT-AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。 To construct prokaryotic expression vector pET32a-AcGFP1 and make it express efficiently in E. coli cell, the AcGFP1 gene of green fluorescent protein was amplified from pIRES-AcGFP1 plasmid with PCR method, and was inserted into prokaryotic expression vector pET32a (+) by restriction enzyme digestion. After identified by PCR, restriction enzyme digestion and sequencing, the AcGFP1 gene was induced with different concentrations' isopropyl-(3-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and detected on 15% SDS-PAGE. Results showed that the sequence of AcGFP1 gene in pET32a-AcGFP1 recombinant plasmid is consistent with that AcGFP1 sequence in pIRES-AcGFP1 plasmid from Clontech Ltd, proving that the prokaryotic expression vector with AcGFP1 gene of green fluorescent protein is constructed successfully. Moreover, all of the pET32a-AcGFP1 plasmids transformed in E. coli Rosetta (DE3) were high efficient expression after inducing by different concentrations of IPTG. Results above will provide a basis on constructing pET32a(+)-TAT-AcGFP1 fusion expression vector and studying deeply mechanism of TAT cell membrane penetration.
Keywordsgreen fluorescent protein   gene cloning   reporter gene   prokaryotic expression     
Received 2012-06-28;
Fund:

云南农业职业技术学院科学研究与技术开发重点项目(YNAVC201116);云南省教育厅科学研究基金项目(2011C191);国家自然科学基金项目(31160439)

Corresponding Authors: 霍金龙(1975-), 男, 山西五寨人, 博士, 高级实验师, 主要从事动物遗传学研究。E-mail:jinlonghuo@ynau.edu.cn, bnwxzjjx@yahoo.com.cn     Email: jinlonghuo@ynau.edu.cn;bnwxzjjx@ yahoo.com.cn
About author: 霍海龙(1982-), 男, 山西五寨人, 助教, 博士研究生, 主要从事动物分子生物学方面的遗传研究。E-mail:liuoliailong2006@yalioacom.cn;赵跃(1967-), 男, 云南景东人, 副教授, 主要从事动物遗传学方面的研究。E-mail:kmszy@126.com
引用本文:   
霍海龙, 赵跃, 王锐, 侯慧芳, 李卫真, 张永云, 刘丽仙, 王配, 霍金龙.绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达[J]  云南农业大学学报(自然科学), 2012,V27(6): 820-825
HUO Hai-long, ZHAO Yue, WANG Rui, Hou Hui-fang, LI Wei-zhen, ZHANG Yong-yun, LIU Li-xian, WANG Pei, HUO Jin-long .Construction of Prokaryotic Expression Plasmid pET32a-AcGFPl of Green Fluorescent Protein and Their High Efficient Expression in Escherichia Coli[J]  Journal of Yunnan Agricultural University, 2012,V27(6): 820-825
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